微精选

见图一

小鼠不同实际年龄的乳腺干细胞富集群体的 scRNAseq 分析。

图一

a 显示小鼠乳腺细胞 scRNA-seq 管道的示意图。对 2 个月至 29 个月大小鼠的解离乳腺细胞进行 CD49f 分选高EpCAM 技术低乳腺干细胞富集的群体，然后进行 3’UTR SMARTseq 进行文库构建和后续测序。

b t-SNE 图显示了源自 2 m （n = 2）、4 m （n = 3）、9 m （n = 2）、11 m （n = 2）、13 m （n = 2）、15 m （n = 4）、17 m （n = 2）、19 m （n = 2）、22 m （n = 2）、24 m （n = 1） 和 29 m （n = 3） 小鼠的乳腺细胞聚集。

c t-SNE 上的基底细胞特异性基因（角蛋白 5 和角蛋白 14）显示出均匀的表达模式。

d 通过 Monocle 2 推断乳腺衰老轨迹的单细胞转录组的伪时间排序分析。单元格起点由不同的颜色标记。

e 伪时间动态基因表达的热图可视化。根据差异表达的基因簇将细胞分为 4 种状态。

f 沿伪时间的每种细胞状态的特征基因簇的表达模式。

g 细胞密度图显示了年轻 （2 m-4 m， n = 5）、中年（9 m-13 m，n = 6）、老年 （15 m-22 m，n = 10） 和老年 （24 m-29 m，n = 4） 小鼠的乳腺细胞分布以及伪时间。h 每种细胞状态下每只小鼠年龄的相对细胞比例。i 每个年龄组中四种乳腺细胞状态的相对细胞丰度。

见图二

沿衰老轨迹的不同乳腺细胞状态的特征。

a 伪时间上的富集分数表示的每个信号通路的活性。注意：确定了六种不同的动态模式，表明每种细胞状态的身份。

b 状态 1（n = 344 个细胞）和状态 2（n = 588 个细胞）细胞之间的不同通路活性。使用双侧 wilcoxon 检验进行统计分析。

c 细胞周期分析显示每种细胞状态下循环细胞（蓝色）和静止细胞（红色）的相对分数。

d 每种细胞状态下 G1 期细胞的相对比例。

e、f 衰老相关通路分析显示每种细胞状态下的细胞衰老水平 （e） 和 SASP 表达水平 （f）。State344、State588、State740 和 State3 中分别有 1、2、3 和 4 个单元格。使用双侧 wilcoxon 检验进行统计分析。

g 四种细胞状态的示意图，分别是活跃的年轻状态 （a-Young）、静止的年轻状态 （q-Young）、早期衰老 （e-Sen） 和晚期衰老 （l-Sen）。

h–k 年轻和老年乳腺组织中 p-p65 （h）、IL6 （i）、SSEA1 （j）、OCT4 （k） 免疫组织化学染色的代表性图像。值是 SD ±平均值（n = 6 个生物学重复）;p，双尾未配对 t 检验。

见图三

衰老细胞易患癌症。

图三

a-b 图显示了来自 TCGA 数据库的人乳腺肿瘤和肿瘤邻近组织中主题通路评分和转录因子活性评分的分析工作流程。n = 112 名患者;p，双尾配对 t 检验。

c 示意图显示了 6 周龄 WT 小鼠的 DMBA 诱导的癌症测定。

d DMBA 诱导的乳腺肿瘤的代表性 wholemount 染色图像。

e–h 代表 IL6 （e）、p-p65 （f）、OCT4 （g）、SSEA1 （h） DMBA 诱导的乳腺肿瘤的 IHC 染色图像。值是 SD ±均值。控制：n = 3;瘤前：IL6 的 n = 6;p-p65、OCT4、SSEA1 的 n = 7;n 代表生物学重复;p，双尾未配对 t 检验。

i 图表显示 8 周龄小鼠接受 DMBA （200 μL， 5 mg/mL） 处理并通过 scRNA-seq 分析。

j 每个年龄组和 DMBA 处理组的乳腺细胞状态密度图。k 与年轻 （2-4 m） 组相比，不同年龄组细胞状态的相对丰度变化。

l CD49f 中衰老相关通路评分高EpCAM 技术低DMBA 处理的乳腺细胞。来自 3 只对照小鼠的 236 个细胞，来自 2 只 DMBA 处理小鼠的 109 个细胞。使用双侧 wilcoxon 检验。

m、n、对照（4 个月，n = 4 只小鼠）和 DMBA 处理的小鼠（4 个月，n = 4 只小鼠）的乳腺代表性 β-gal 染色图像 （m） 和定量 （n），显示衰老细胞。使用双尾未配对 t 检验进行统计分析;数据以 SD 的平均±表示。

o-p CD49f 集落形成能力的代表性图像 （o） 和定量 （p）高EpCAM 技术低2-4 M WT（n = 5 只小鼠）、12-13 M WT（n = 5 只小鼠）、22-29 M WT（n = 8 只小鼠）乳腺中的乳腺细胞。使用双尾未配对 t 检验进行统计分析;每只小鼠 3 个技术重复;数据以 ± SD 的平均值表示。

q 线性谱系轨迹显示了四种细胞状态的转换概率，节点大小对应于信号熵。四种细胞状态的 r sc熵分析。细胞数：344 （a-Young）、588 （q-Young）、740 （e-Sen）、309 （-Sen）、109 （DMBA 组）。使用双侧 wilcoxon 检验进行统计分析，并使用 BH 校正的 p 值。

见图四

q-Young 到 e-Sen 的转变在功能上由转录因子 Bcl11b 介导。

图四

a 显示了使用 ENCODE、ChEA 和 TRRUST 数据库对每种细胞状态进行转录因子富集分析的工作流程的图表。至少两个数据库支持调节每种状态的转录因子的可靠候选者。

b 表格显示了基于每种细胞状态中差异表达基因的富集转录因子。黑线表示 TFs 在两个数据库中富集。

c 在伪时间内由靶基因指数表示的富含 e-Sen 状态的转录因子的活性评分。

d 年轻（3 个月）、年龄（17 个月）和 K14-Cre Bcl11b 的乳腺 β-gal 染色图像FL/FL（3 个月）小鼠显示衰老细胞。比例尺，20 μm。

e p16 的百分比墨水4a来自年轻（4 个月，n = 10 只小鼠）、老年（22 个月，n = 10 只小鼠）、对照 K14-Cre Bcl11b 的乳腺上皮细胞中的阳性细胞（比例尺，20 μm）重量/重量（4 个月，n = 8 只小鼠）和 K14-Cre Bcl11bFL/FL（4 个月，n = 9 只小鼠）小鼠。使用双尾未配对 t 检验进行统计分析;数据以平均值表示± SD。

f 年轻 （n = 54 只小鼠） 和老年 （n = 13 只） 乳腺上皮细胞的相对基底管腔比例。通过双尾未配对 t 检验确定统计显着性;数据以平均值± SD 表示。

g K14-Cre Bcl11b 中乳腺上皮细胞相对基底/管腔比例的定量FL/FLmTmG 报告小鼠 （n = 9 只小鼠）。通过双尾未配对 t 检验确定统计显着性;数据以 SD ±平均值表示。

h、i 每个年龄组和乳腺细胞状态的密度图 （h） 和百分比 （i） 以及 K14-Cre Bcl11bFL/FL群。

j 京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 通路分析显示通路显著富集于 K14-Cre Bcl11bFL/FLCD49f高EpCAM 技术低细胞。使用 clusterProfiler 包中的 enrichKEGG 富集通路，并使用 BH 调整后的 p 值。

k 显示 K14-Cre Bcl11b 的 scEntropy 分数的箱线图FL/FLCD49f高EpCAM 技术低细胞增加到类似于 L-Sen 细胞的水平。细胞数：360 （a-Young）、666 （q-Young）、664 （e-Sen）、291 （l-Sen）、149 （K14-Cre Bcl11b）FL/FL).使用双侧 wilcoxon -test。

l WT（来自 3 只小鼠的 n = 236 个细胞）和 K14-Cre Bcl11b 的 SASP 基因评分比较FL/FL (n = 来自 3 只小鼠的 149 个细胞）CD49f高EpCAM 技术低细胞。使用双侧 wilcoxon -test。

见图五

敲除 Bcl11b 表达诱导的 l-Sen 细胞本质上容易转化为癌细胞。

图五

a 示意图显示了 DMBA 诱导的年轻和老年移植乳腺细胞的癌症测定。上图：使用相同 MRU 移植 2 个月大的年轻乳腺细胞 （wt） 和 24 个月大的乳腺细胞 （具有 GFP 报告基因） 乳腺细胞的小鼠进行肿瘤形成测定。细胞移植后，如示意图所示，用 MPA 加 DMBA 处理小鼠。下面板：使用相同 MRU 移植 2 个月大的年轻乳腺细胞 （具有 tdTomato 报告基因） 和 12 个月大的乳腺细胞 （wt） 的小鼠进行肿瘤形成测定。细胞移植后，如示意图所示，用 MPA 加 DMBA 处理小鼠。

b 来自年轻和老年乳腺细胞的肿瘤的代表性图像。比例尺，1 mm。

c 年轻和年老乳腺细胞的生长肿瘤百分比。

d 显示野生型和 K14-Cre Bcl11b 的 DMBA 诱导癌症测定的示意图FL/FL移植的乳腺细胞。用 WT 或 K14-Cre Bcl11b 移植的小鼠FL/FL乳腺细胞用于肿瘤形成测定。细胞移植后，如示意图所示，用 MPA 加 DMBA 处理小鼠。

e DMBA 诱导的 WT 和 K14-Cre Bcl11b 癌症测定的无肿瘤生存曲线FL/FL移植的乳腺细胞。通过 log-rank 检验确定统计分析。潜伏期从最后一次 DMBA 治疗之日起计算。

f WT 和 K14-Cre Bcl11b 的癌症发病率FL/FL在每个指定的潜伏期时间（每个时期 30 天）移植小鼠。

g 基因集富集分析 （GSEA） 显示 WT 肿瘤细胞富集了 a-young 特征基因和 K14-Cre Bcl11bFL/FL肿瘤细胞富含 L-Sen 特征基因。使用 clusterProfiler 包中的 GSEA 执行分析。

h WT 和 K14-Cre Bcl11b DMBA 诱导肿瘤中差异表达基因的 KEGG 通路分析FL/FLCD49f高EpCAM 技术低细胞。使用 clusterProfiler 包中的 enrichKEGG 富集通路，使用 BH 调整后的 p 值。

i SASP 和 NF-kB 相关基因在 K14-Cre Bcl11b 中上调FL/FLCD49f高EpCAM 技术低肿瘤细胞。WT（来自 3 只小鼠的 n = 236 个细胞）和 K14-Cre Bcl11bFL/FL (n = 来自 3 只小鼠的 149 个细胞）;使用双侧 wilcoxon -test。

见图六

多个衰老相关通路受 Bcl11b 控制。

图六

a 转录起始位点 （TSS） 的整体 Bcl11b ChIP-seq 峰的分布。

b 饼图显示了 Bcl11b ChIP-seq 峰在不同基因组区域的分布。Bcl11b ChIP 靶标的 c-d KEGG （c） 和 GO （d） 通路分析。使用 clusterProfiler 包中的 enrichKEGG （c） 或 enrichGO （d） 富集通路，使用 BH 校正 p 值。

e–h NF-kB 荧光素酶报告基因测定显示 Bcl11b 表达调节 NF-kB 活性。用 TNFα（e;20 ng/mL，n = 6 个生物重复）、LPS-PG（f;1 μg/mL，n = 6 个生物重复）、LPS-EB（g;10 个生物重复）处理具有 NF-kB 荧光素酶报告基因的 pInducer-Bcl11b 逗号 Dβ 细胞3EU/mL，n = 6 个生物重复），PMA（h;100 ng/mL，n = 6 个生物重复）。数据以 ± SD 的平均值表示。

i p65 的免疫荧光显示 Bcl11b 的诱导表达有效抑制了 tTNFa （20 ng/mL） 诱导的 p65 在 pInducer-Bcl11b Comma Dβ 细胞中的核输入。红色：第 65 页;绿色：Bcl11b;蓝色：DAPI。用 3 个生物学独立的样品重复 3 次。

j Western blot 分析显示多西环素 （50 ng/mL） 诱导的 Bcl11b 表达抑制了 pInducer-Bcl11b Comma Dβ 细胞中 TNFα （20 ng/mL） 处理后 IκBα 降解和 p65 磷酸化。n = 3 个生物学独立样本;重复 3 次。

k Western blot 分析显示，在 pInducer-Bcl11b Comma Dβ 细胞中，多西环素 （50 ng/mL） 诱导的 Bcl11b 表达在 TNFα （20 ng/mL） 处理后抑制了 IKKa/b 磷酸化。n = 3 个生物学独立样品，重复 3 次。

l 实时 PCR 确认 Irak2 mRNA 表达受诱导的 Bcl11b 表达调节。n = 3 个生物学独立样本;数据以 SD ±平均值表示;双尾未配对 t 检验。m 显示 WT CD49f 移植的极端极限稀释分析 （ELDA） 图高EpCAM 技术低用 pCDH 或 pCDH-IKKb 载体转导的细胞。

n.s.，不显著。n 显示 K14-Cre Bcl11b 移植的 ELDA 图FL/FLCD49f高EpCAM 技术低用 pCDH 或 pCDH-IKKb 载体转导的细胞。

o CD49f 的集落形成测定高EpCAM 技术低来自 WT 和 K14-Cre Bcl11b 的细胞FL/FL用 pCDH （n = 3 只小鼠） 或 pCDH-IKKb （n = 3 只小鼠） 载体转导的小鼠。数据以 SD ±平均值表示;双尾未配对 t 检验;每只小鼠 3 个技术重复;n.s.，不显著。

好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理.  数据分析等支持.也随时可以联系我们。