背景:

     本研究调查了慢性失眠障碍(CID)具有性别特异性静息态功能连接(rsFC)改变的假设,某些分子机制可能通过改变相关网络中的rsFC来影响CID的病理生理学。

方法:

     利用395名参与者的静息态功能磁共振成像(fMRI)数据集,包括199名CID患者和196名健康对照者,我们检查了性别特异性rsFC效应,特别是在默认模式网络(DMN)和五个失眠遗传易感兴趣区域(ROIs)中。通过整合Allen Human Brain Atlas的基因表达数据,我们识别了与这些性别特异性rsFC改变相关的基因,并进行富集分析以揭示潜在的分子机制。此外,我们模拟了不同性别构成对我们数据集中rsFC性别差异的影响,并采用机器学习分类器根据性别特异性rsFC数据区分CID与健康对照者。

结果:

     我们在DMN和五个遗传易感ROIs中识别了共同和性别特异性的rsFC改变,基因表达变异与这些性别特异性连接差异相关。富集分析突出了参与突触信号传导、离子通道和免疫功能的基因,这些基因可能通过影响连接性来促进CID(慢性失眠障碍)病理生理学。此外,我们的发现表明,不同的性别构成显著影响研究结果,性别特异性rsFC数据比合并性别数据具有更高的诊断性能。

结论:

     本研究揭示了CID中共同和性别特异性的连接改变,为其病理生理学提供了分子见解,并建议在未来基于fMRI的诊断和治疗策略中考虑性别差异。本文发表在BMC Medicine杂志。

背景

     慢性失眠障碍(CID)是一种复杂的疾病,表现多样,与其生物学基础的联系尚不清楚。荟萃分析显示,女性患CID的风险比为1.4,是男性的1.4倍,表明女性性别是一个危险因素,尽管CID性别差异的确切原因仍然难以捉摸。CID对大脑结构和功能的影响存在微妙但显著的性别差异,症状类型也是如此。例如,经常伴随失眠的焦虑和抑郁在女性中往往比男性更普遍。先前的研究还发现了与失眠相关的性别特异性遗传表达,表明不同的生物学过程可能在男性和女性中影响这种疾病。

     静息态功能磁共振成像(rsfMRI)对于理解CID的神经生物学至关重要。研究发现默认模式网络(DMN)、皮层下区域和其他CID相关网络中的静息态功能连接(rsFC)发生改变,这些改变具有作为跨诊断标记物和缓解生物标记物的潜在用途。CID相关fMRI研究中一个一致的发现是DMN中连接的改变,这种模式也在自闭症、抑郁症和精神分裂症等各种神经精神疾病中观察到。DMN中的这种连接改变与冲突控制和焦虑等问题相关,可能成为神经刺激和生物反馈等干预的目标。其他研究发现DMN和执行控制网络之间存在分歧的相互作用,这可能导致白天认知功能障碍。然而,关于CID中DMN连接的研究呈现混合结果,一些研究表明rsFC减少;其他研究则没有,并且缺乏对该网络中rsFC的大规模分析。令人惊讶的是,迄今为止相对有限的研究测试了CID中rsFC的性别特异性效应,部分原因是功效限制。CID是否与女性和男性中不同的rsFC模式相关仍不清楚。

    导致CID中rsFC改变的潜在分子机制也仍不清楚。涉及超过100,000名参与者的全基因组关联研究已经识别了CID的许多遗传风险变异,突出了高度多基因遗传模式,其中每个变异对总体风险的贡献很小。这些众多遗传因子在CID病理生理学中的复杂相互作用尚不清楚。新兴证据表明,大脑基因表达的空间变异可能影响rsFC。例如,研究表明基因表达的区域差异可能与抑郁症和精神分裂症等神经精神疾病中形态测量和连接变化的分布相关。然而,这些区域基因表达差异是否能特异性解释CID中观察到的特定连接和网络内的rsFC变化仍不确定。此外,CID中rsFC的这些遗传相关性是否在性别之间存在差异仍不清楚。

     在我们的研究中,我们试图验证以下假设:(1)CID与异常连接的性别特异性模式相关,(2)特定的分子机制可能通过调节功能连接来影响CID病理生理学。利用包含395个个体的大量rsfMRI数据集,包括CID患者和健康对照者,我们首初探索CID是否与性别特异性rsFC效应相关。我们的重点是已知在失眠fMRI研究中涉及的DMN,以及在CID中显示遗传易感性的五个兴趣区域。此外,使用Allen Human Brain Atlas(AHBA)的微阵列数据,我们调查了某些分子机制是否可能通过改变相关网络中的功能连接来潜在地影响CID病理生理学。此外,为了评估这些观察到的性别差异如何影响未来的研究,我们调查了不同性别构成对rsFC性别差异的影响,并利用机器学习分类器根据性别特异性rsFC数据区分CID与健康对照者。

方法

招募和评估

     CID的诊断通过五名具有8-15年精神病学经验的神经科医生根据《精神疾病诊断与统计手册》第五版(DSM-V)和《国际睡眠障碍分类》第三版(ICSD-3)[43]进行结构化访谈。纳入和排除标准在补充方法(附加文件1:方法S1)中详述。所有参与者都了解研究目的并提供了知情书面同意。由于头部运动过度(fMRI预处理排除标准见下文),12名健康受试者和21名CID患者被排除,剩余199名CID患者和196名健康对照者(HCs)可用于分析。CID和HCs的临床和人口学特征总结在表1中。

表1 CID和健康对照者的人口学和临床特征

神经影像数据采集

    使用GE 3.0T MRI扫描仪采集T1w和rs-fMRI图像。使用以下设置采集矢状位3D T1加权图像:重复时间(TR)= 7.06 ms;回波时间(TE)= 3.04 ms;翻转角(FA)= 12°;采集矩阵 = 256 × 256;层厚 = 1 mm,无间隙;和188个矢状位层面。rs-fMRI图像使用以下参数获得:TR = 1700 ms,TE = 30 ms,FA = 90°,采集矩阵 = 64 × 64,体素大小 = 3.75 × 3.75 × 3.2 mm³,厚度 = 3.5 mm,层数 = 33。

MRI数据预处理

    T1w和rs-fMRI数据的预处理在fMRIPrep 22.1.1管道上进行。对于T1w图像,进行了一系列程序,包括强度不均匀性校正、颅骨剥离、组织分割,以及通过非线性配准进行标准空间的空间标准化。fMRI预处理程序包括参考体积生成、时空滤波前的头部运动参数估计、层时校正、与T1w参考的共配准、混杂时间序列提取,以及重采样到标准空间。在上述过程中,为每个受试者计算整个时间点的逐帧位移(FD)和体素RMS方差时间过程的标准时间导数(DVARS)作为头部运动测量。此外,fMRIPrep用于从预处理时间点估计36个混杂因子。这些混杂矩阵在xcp_d 0.0.4内用于减轻rsfMRI数据中的运动相关伪影和噪声。然后从广泛验证的功能分割定义的360个皮层区域和19个皮层下区域提取处理后的功能时间序列。在每个片段部分覆盖的情况下,未覆盖的体素(全零值或NaN值)要么被忽略(当片段覆盖率> 50.0%时),要么被设为零(当片段覆盖率< 50.0%时)。然后计算成对功能连接,操作化为每个片段未平滑时间序列的Pearson相关性。如果受试者基于FD有超过20%的时间点具有0.5 mm运动和/或1.5标准DVARS,则被排除。由于头部运动过度,12名健康受试者和21名CID患者被排除。更多详情见”附加文件1:方法S2″。

CID和性别对DMN和五个遗传易感兴趣区域中rsFC的影响

    利用血氧水平依赖信号的预处理时间序列数据,我们生成了描述DMN内83个兴趣区域(ROIs)(附加文件1:表S1)之间连接及其与其他大脑区域相互作用的rsFC矩阵。采用双因素方差分析(ANOVA)来描述CID诊断的影响以及性别与CID之间对rsFC矩阵属性的相互作用。随后进行事后t检验以确定诊断为CID的男性和女性受试者与其各自HC组相比的显著rsFC改变。我们还通过总结在男性和女性组中都显示统计学显著性的大脑区域的事后t值来计算跨性别的共同效应。这些共同效应突出了在性别间具有一致CID影响的区域子集。统计学显著性阈值设为p < 0.05,经假发现率(FDR)校正调整以控制I型错误(n = 379次比较)。

    此外,我们使用双因素ANOVA测试CID诊断的主效应以及来自先前研究中显示异常基因表达特征的五个ROI种子的性别×CID相互作用对rsFC的影响。这些区域包括背外侧前额叶皮层(DLPFC;Brodmann区[BA] 9)、前扣带皮层(ACC;BA24)、伏隔核(NAc)、尾状核(CNs)和壳核。采用类似的事后t检验来揭示CID患者与其各自HC组相比的显著rsFC变化。显著性水平设为pFDR < 0.05。维恩图用于说明男性和女性失眠患者中明显观察到的rsFC改变,以及两组共同的改变。此外,我们评估性别特异性rsFC变化的数量是否超过随机机会预测的水平。这通过将观察到的数量与数据集内性别标签的随机排列进行对比来进行。

从分子角度解码rsFC变化

    本研究首先从AHBA描述规范基因表达模式,并将这些谱系映射到Glasser功能分割上。随后,采用偏最小二乘回归(PLS-R)来识别基因表达模式与性别特异性连接改变之间的协方差。对五个特定ROI(DLPFC(背外侧前额叶)、ACC(前扣带皮层)、NAc(伏隔核)、CNs(尾状核)和壳核)内的男性和女性参与者分别进行PLS-R分析,以捕获相关的基因表达。此外,为了解释PLS-R结果,我们使用基因类别富集分析来理解在最高度相关基因中富集了哪些分子通路。

微阵列基因表达图的估计

    使用abagen工具箱处理AHBA基因表达数据,包括基于强度过滤微阵列探针、每个基因选择单个探针、将样本匹配到功能分割定义的大脑区域、标准化,以及在分割内和跨分割聚合数据等步骤。最终的基因表达数据由每个供体的360 × 15,633矩阵表示,将大脑区域与保留的基因相关联。此外,移除供体间相似性低的基因(r < 0.2),共计12,506个基因。由于右半球数据仅对两名参与者可用,转录组学-影像学关联分析仅限于左半球皮层区域,表示为180区域 × 12,506基因矩阵。

识别与性别特异性rsFC变化相关的基因表达数据

     应用PLS-R探索区域连接变化与基因表达模式之间的关系。为五个遗传易感ROI:DLPFC、ACC、NAc、CNs和壳核的两个性别分别开发不同的PLS-R模型。总共生成了十个模型(5个ROI × 2个性别)。每个模型利用包含AHBA区域基因表达数据的预测矩阵(180 × 12,506)对抗180个元素的响应向量,该响应向量表示来自每个性别五个ROI之一的左皮层区域中CID相关连接改变的幅度。PLS1表示基因表达评分的线性复合,加权以反映它们与区域连接改变的集体协方差最密切。该组分旨在捕获基因表达(预测因子)和连接变化(响应)之间的最大协方差,尽管它不专门关注响应变量内的方差。以下分析主要集中在PLS1上。为了确定每个基因在PLS1内贡献的稳健性和显著性,采用了引导技术,涉及跨180个大脑区域的10,000次重采样迭代。该程序使能够计算每个基因的Z分数,基于其PLS1负荷与引导标准误差的比率,从而促进对基因对PLS1贡献的排名评估。该过程的分析代码改编自Sarah Morgan在GitHub上提供的公开可用资源。

PLS组分的统计检验

     为了验证PLS模型揭示的基因-神经影像学相关性的统计学显著性,我们将真实数据导出的PSL1与零分布进行比较。这些分布从10,000次空间排列(”旋转测试”)生成。该排列涉及基于皮层表面球面投影随机旋转神经影像学向量行。空间排列技术可在https://github.com/frantisekvasa/rotate_parcellation获得。该方法确保保留皮层表面数据的固有相关结构,与传统随机排列测试相比,提供严格的假阳性控制。此外,通过在10,000次迭代中随机洗牌响应向量内的所有180个ROI来进行更简单的零模型。对男性和女性组的五个预定ROI各重复该过程,产生十个不同的零模型。这些模型促进了对每个性别ROI特定模型的零PLS1方差与从原始数据导出的实际PLS1方差的检查。超过空间旋转(pspin)和随机排列(prand)零模型解释方差分布中第95百分位数的PLS1解释方差被认为具有统计学显著性。使用FDR校正对十个PLS-R模型(5个ROI × 2个性别)的多重比较调整显著性水平。

PLS1的可重现性测试

    为了评估上述十个PLS-R模型揭示的基因-神经影像学相关性的可重现性,我们对每个模块进行了十轮十折交叉验证。每个模型在随机选择的90%受试者子集上训练,在训练(90%)和测试(10%)组中保持一致的CID病例比例。然后我们分别使用双样本t检验计算rsFC效应作为训练集和测试集的响应变量。之前从训练过程中保留的10%受试者子集对CID对rsFC的影响然后被应用于预测训练样本。保留数据的预测能力使用Pearson相关系数(rho)量化,计算如下:

    在此,rho表示保留数据中的皮尔逊相关系数,其中Ytrain代表来自训练子集的响应向量,X是基因预测矩阵,Ytest是来自保留子集的响应向量。表达式X*Ytrain是使用PLS-R在90%的数据上训练的PLS1载荷权重。这个过程被重复了100次——跨越十次十折交叉验证的十个周期——每次重复采用不同的随机选择的10%子集,以确保跨多个数据分割的稳健验证。此外,为了评估保留数据中预测能力的统计显著性,CID的诊断标签被随机置换,并在相同的100次迭代中对rho进行零置换检验。使用校正重抽样t检验比较来自真实和置换数据的十折交叉验证的平均rho值,然后计算代表PLS-R模块中rho的显著性的p值。上述过程为跨5个ROI × 2个性别的总共十个PLS-R模块产生了10个可重现的p值。然后这10个p值用于FDR校正,显著水平为pFDR < 0.05。

基因类别富集分析

  对于统计显著的PLS模型,使用基因类别富集分析工具(可在https://github.com/benfulcher/GeneCategoryEnrichmentAnalysis获得)测试得到的排序基因列表(Z分数 > 3 或 < -3,pFDR < 0.05)是否过度代表基因本体(GO)术语。生物过程类别与基因本体(geneontology.org)中注释的特定基因子集相关。对于每个显著的PLS模型,富集类别的分数计算为bootstrap过程中该类别内的平均基因Z分数。通过将响应变量置换10,000次创建零模型,使用先前描述的自旋测试确保空间自相关的维持。在此之后,PLS分析重新应用于原始基因表达矩阵和置换的响应变量,允许重新计算零基因并富集零GO类别生物过程。基于每个GO类别相对于置换次数的出现频率计算显著性p值(pspin)。显著水平设定为pspin < 0.05。

    此外,我们对所有显著和可重现的PLS-R模型中识别的显著基因(Z分数 > 3 或 < -3,pFDR < 0.05)进行了重叠分析,以描绘与性别特异性连通性变化相关的共享基因表达谱。进而,为了全面阐明基因表达与连通性改变之间的关系,我们进行了多基因列表荟萃分析。该分析将来自失眠全基因组关联研究(GWAS)的风险基因与来自显著PLS-R模型的显著基因列表(Z分数 > 3 或 < -3,pFDR < 0.05)整合。使用Metascape平台分别对每个PLS模型进行荟萃分析。

模拟rsFC中性别差异的影响

     为了阐明性别组成对CID相关rsFC结果和fMRI生物标志物发展的影响,进行了两项分析。首先,我们通过模拟1000个具有不同性别组成的研究来评估基于性别效应的潜在影响。这些模拟使用我们数据集的不同性别组成子集探索了CID对rsFC的影响,范围从完全CID到完全HC队列。具体地,每个模拟涉及60名CID个体和70名HC的子集,分层为七种不同的性别比例(0%、20%、33%、50%、67%、80%和100%女性),在CID和HC组中均匀应用。在这些子集的每次迭代中,采用线性回归模型评估CID对连接83个DMN区域的所有rsFC特征均值的影响,年龄作为协变量。显著水平设定为pFDR < 0.05(n = 379次比较)。

     其次,训练弹性网正则化广义线性模型(EN-GLM)以使用仅男性、仅女性和混合性别rsFC数据预测CID状态,我们比较了这些模型的性能。对于每个模型类别(男性、女性、混合性别),随机选择94名受试者进行模型训练,从同一类别中选择独立的47名受试者测试集进行验证,旨在评估每个EN-GLM的预测性能。这个过程重复了100次,便于计算所有三组模型的平均性能指标,特别是受试者工作特征曲线下面积(AUC)。对于每次迭代,指定用于测试的47名受试者专门保留用于模型评估,确保与训练阶段没有重叠。选择连接83个DMN区域的皮质和皮质下区域379个区域中每个rsFC的均值作为训练EN-GLM的特征。EN-GLM结合了设置为0.5的alpha参数,以平等地平衡ridge和lasso惩罚。利用MATLAB的”lassoglm”函数,该函数循环80个lambda值,模型在可变特征集上进行优化,特征集大小从1到379个特征不等。在100次建模迭代过程中导出的每个特征的beta权重被平均以计算绝对载荷权重作为分类中特征重要性的指标。这个平均绝对载荷权重在脑图上进行视觉表示,说明了跨男性、女性和混合性别EN-GLM预测CID状态重要特征的解剖分布。

结果

与DMN相关的共享和性别特异性效应

     我们的分析发现了CID的广泛主效应,特别明显的效应在前/后扣带皮层、背内侧前额皮层和脑岛观察到(图1a),证实了先前失眠神经影像荟萃分析的发现。此外,我们识别出与性别相关的显著主效应(图1b)以及性别和CID之间的交互作用,这些在先前研究中尚未得到充分探索,这些交互效应主要在腹内侧前额皮层、后扣带皮层和内侧颞皮层的广泛区域观察到(图1c)。后续的事后分析揭示了跨性别的少数共享效应(图1d;附加文件1:图S1),如腹内侧前额皮层连通性的减少,以及众多性别特异性效应。值得注意的是,DMN内的性别特异性低连通性主要在男性中观察到,特别是在后扣带皮层和腹内侧前额皮层(图1e;附加文件1:表S2)。相比之下,患有CID的女性在内侧颞皮层显示性别特异性rsFC的减少(图1f;附加文件1:表S3)。此外,我们在其他区域进行了事后分析以探索性别不同的效应,未发现显著交互作用。我们观察到患有CID的女性在上顶叶皮层、内侧扣带皮层和视觉皮层等区域表现出性别不同的rsFC增加,而患有CID的男性主要在背内侧前额皮层表现出性别不同的rsFC减少(图1e, f)。

图1 与DMN相关的共享和性别特异性rsFC效应

    a–c 颜色图显示来自双因素ANOVA的显著F统计量(pFDR < 0.05)的分布,通过分析连接83个DMN感兴趣区域的每个脑区的rsFC效应。通过对83个DMN节点求和,为每个功能脑区总结整体显著CID主效应(a)、性别主效应(b)和CID与性别交互效应(c)。

    d–f 总结CID-性别交互效应中的事后t值以进行神经解剖可视化,分别绘制男性(d)、女性(e)和两性(f)的rsFC变化,类似于a、b和c中的求和方法。通过将Glasser脑区分组到相关网络来汇总结果可在附加文件1:图S1中找到。红色虚线圆圈的注释表示性别特异性DMN相关改变,黑色虚线圆圈表示性别不同的DMN相关改变,绿色虚线圆圈标记共享连通性变化,如正文中所讨论。

缩写:DMN,默认模式网络;CID,慢性失眠障碍;HC,健康对照;rsFC,静息态功能连通性;L,左;R,右

     为了更深入地研究CID状态、性别和DMN内连通性之间的关系,我们分析并可视化了检查CID跨性别影响和HC组内性别影响的事后t检验结果(图2a–c)。注意到DMN内的连通性在诊断为CID的男性中主要减少(图2a),在健康女性中(图2b),当每个与没有CID诊断的健康男性比较时。考虑到男性(M = 38.01,SD = 12.37)和女性HC(M = 34.30,SD = 12.83;t (194) = 2.00,p = 0.047)之间的显著年龄差异,我们应用事后线性回归模型,调整年龄,以确认健康男性相比女性DMN连通性的减少。补充分析进一步证实了这一发现(附加文件1:图S2)。观察到的CID对女性DMN连通性影响的相对增强(图2c)可归因于健康女性相比男性对应者DMN连通性的既有减少。这些观察结果在几个DMN子区域中保持一致,包括前部(下额皮层、背外侧前额皮层和前扣带皮层)以及外侧部分(下顶叶皮层)。

图2 DMN内的性别特异性rsFC效应。圆形图(a–c)显示十一个DMN子区域中的rsFC,颜色和带宽反映平均显著t统计量(pFDR < 0.05)。暖色表示CID患者相比HC(a, c)或健康女性相比健康男性(b)的连通性增强。

缩写:DMN,默认模式网络;CID,慢性失眠障碍;HC,健康对照;Insula_FrontalOperc,脑岛_和_额叶岛盖;AntCing_MedPFC,前扣带_和_内侧前额;OrbPolaFrontal,眶极额叶

五个遗传易感ROI中的共享和性别特异性效应

     我们识别了CID对所有五个ROI中rsFC的共享和性别特异性效应(图3a;附加文件1:图S3)。性别特异性影响的实例在所有五个ROI中明显比两性共同的效应更普遍,这些效应中许多在男女之间明显不同,有时方向相反(图3b–d)。女性通常表现出连通性增加,而男性显示连通性减少。例如,在DLPFC中,CID对rsFC的影响在性别间显示出鲜明对比。患有CID的男性对几个区域的连通性减少,包括内侧前额、颞极和内侧扣带皮层(图3d),这种模式在女性中未见(图3b)。在其他区域如伏隔核、前扣带皮层、尾状核和壳核,大多数效应对一个性别是独特的,两性间共享的比例较小(范围从5.5到8.0%)(图3e)。为了评估性别特异性效应的发生率是否超过随机机会预期,我们评估了这些效应的患病率与性别标签随机置换的数据集结果的对比。该分析确认了所检查的五个区域中两个存在显著的性别特异性效应(图3f)。

图3 五个遗传易感感兴趣区域的性别特异性效应(a)。

   b–d 颜色图显示CID与健康对照t统计量,显示跨五个ROI的女性特异性(b)、两性共同(c)和男性特异性(d)rsFC效应。每行标记一个种子,显示两个半球功能脑区的峰值t统计量。显示CID、性别或其交互显著主效应(pFDR < 0.05)的脑区在图S3中详述。

慢性失眠障碍的性别特异性静息态功能连接改变:分子机制研究(含代码)

   e 韦恩图量化性别特异性与共享连通性效应,每个种子具有显著阈值(pFDR < 0.05)。

   f 箱线图可视化零模型中的女性(左)和男性特异性(右)连通性效应,通过随机置换性别标签1000次生成。来自(e)的性别特异性效应的经验计数用红色和蓝色点标记。* 表示p < 0.05

性别特异性rsFC效应的转录特征

     应用PLS-R发现基因簇,其表达模式与五个关键ROI内与CID相关的连通性改变的空间变化密切一致(图4a)。为了验证PLS-R识别的基因-连通性关系的一致性和可重现性,我们进行了十次十折交叉验证以评估独立测试数据中的预测能力。这种方法表明基因表达在独立测试数据中与连通性改变表现出空间一致性,最一致和可重现地跨越三个ROI(图4b–e):女性和男性的DLPFC,仅女性的壳核,以及仅男性的NAc(伏隔核)。虽然主要焦点是这些区域最可重现的发现,但通过空间置换测试和采用随机数据洗牌的传统置换测试评估的所有十个模型中也发现了显著的基因-连通性相关性(附加文件1:图S4)。

图4 性别特异性rsFC效应的转录特征

   a 图表说明PLS-R分析以探索跨五个遗传易感ROI(DLPFC、NAc、ACC、CNs和Put)区域基因表达和rsFC变化之间的空间关联。

    b–e 来自PLS-R的散点图显示特定模型中基因表达和rsFC变化之间显著和可重现的相关性:女性DLPFC(b)、女性Put(c)、男性DLPFC(d)和女性CNs(e)。每个点表示脑区的PLS1载荷权重与其rsFC效应的对比。下方显示PLS1相关系数(r)和来自10轮十折交叉验证的平均相关性(rho),显著性通过自旋测试 + FDR校正测试。* 表示pFDR < 0.05。

    f, g 热图描述(b–e)中PLS模型中具有最强正LW(f)和最强负LW(g)的前5个基因(行)的LW Z分数,以列显示。

   h (b–e)四个PLS模型中PLS1载荷权重的Spearman相关性。

缩写:PLS,偏最小二乘;PLS1,第一个PLS组分;LW,载荷权重;DLPFD,背外侧前额皮层;ACC,前扣带皮层;NAc,伏隔核;CNs,尾状核;Put,壳核

     为了阐明不同基因集如何对CID影响的男性和女性特定ROI中观察到的连通性偏差做出贡献,我们对每个模型内的基因进行了优先排序。这通过根据12,506个基因的PLS载荷权重组织实现,载荷权重反映了它们在预测来自每个ROI的连通性变化中的重要性。具有最高正载荷权重的基因,表示在与CID中连通性增强相关的皮质区域中表达增加,如图4f所示。我们的结果揭示了两个关键观察。首先,在女性中,在CNs模型中具有突出正载荷权重的基因在壳核模型中也表现出正权重,而在DLPFC模型中,这些基因通常表现出负权重。其次,DLPFC模型中的基因显示出在性别间不同的趋势,在女性中具有最高正载荷权重的基因在男性的相同ROI中显示较低权重,反之亦然。这种趋势在具有最显著负载荷权重的基因中也明显,如图4g所示,对应于与CID中连通性减少相关区域的高表达。这些观察的定量验证确认了这样的模式在每个模型的顶级基因之外是一致的,如图4h详述的每个模型的PLS1载荷权重向量之间相关性测试的证据。

     随后,采用基因类别富集分析来确定四个先前显著和可重现模型中的显著基因(Z分数 > 3 或 < -3,pFDR < 0.05)是否指示特定的生物过程。通过富集分析,揭示了表现出最高正或负载荷权重的基因显著且主要对应于涉及突触功能、离子通道和免疫信号的通路(图5;附加文件1:图S5)。三个基因——ZDHHC2、VAT1L和CHST1——在所有模型中一致发现(附加文件1:图S6)。此外,我们的结果揭示了GWAS基因列表和来自PLS模型(PLS1 + 和PLS1 −)的基因列表共享额外的GO生物过程,特别是与脑发育和行为相关的过程(附加文件1:图S7)。

图5 与性别依赖rsFC效应相关的PLS1加权基因的功能富集

    四个显著和可重现模型中PLS1 +(Z分数 > 3,pFDR < 0.05)基因富集的前10个显著生物术语:女性DLPFC(a)、男性DLPFC(b)、女性CNs(c)和女性Put(d)。每个术语的统计显著性相对于洗牌预测数据进行评估(”自旋”测试,pspin < 0.05,见方法)。富集类别的平均载荷权重Z分数计算为该类别内的平均基因载荷权重。PLS1-(Z分数 < -3,pFDR < 0.05)基因的前10个生物术语在图S5中呈现。

缩写:LW,载荷权重;BA,Brodmann区;NAc,伏隔核;CNs,尾状核;Put,壳核

性别特异性rsFC效应对生物标志物发展的影响

    为了评估rsFC中性别差异对研究结果的影响,我们在1000个bootstrap数据集(包括60名CID患者和70名健康对照)中分析了DMN连通性变化,涵盖从全男性到全女性队列的性别比例范围。我们的结果显示结果随性别组成明显变化(图6a, b)。主要地,模拟子集内女性比例的增加与DMN内超连通性发现的显著上升相关(图6a)。例如,包含50%和67%女性参与者的样本之间的比较——这是现有失眠神经影像研究中频繁观察到的人口分布——在结果上表现出显著差异。具体地,67%女性组成的样本相比50%女性组成的样本在DMN内超连通性区域显示显著增加(图6b)。

图6 性别特异性rsFC效应对生物标志物发展的影响

    a 箱线图显示与DMN的83个节点相关的rsFC效应平均t统计量的分布,在七种不同性别组成的1000个bootstrap样本中分析。

    b 颜色图详述rsFC效应的神经解剖分布,如a中总结。显著t统计量(pFDR < 0.05)在83个DMN节点间平均,暖色表示连通性的显著增加。

   c 示意图概述用于跨不同组训练和评估EN-GLM的2:1保留方法:仅男性、仅女性和混合性别。

    d, e 图表显示在混合样本上测试和训练的EN-GLM的AUC(黑线),并比较男性特异性(d,蓝线)或女性特异性(e,红线)模型的性能。

    f 颜色图呈现与360个皮质ROI中每个相关的连通性特征的平均绝对载荷权重,基于EN-GLM的100次迭代。图表分割显示仅在男性上训练的模型(左)、仅女性(中心)和无性别区分(右)的结果。

缩写:F,女性;EN-GLM,弹性网正则化广义线性模型;AUC,受试者工作特征曲线下面积

     此外,我们评估了性别特异性rsFC是否会显著影响基于fMRI的诊断生物标志物的性能。这涉及训练EN-GLM从rsFC模式分类CID状态(图6c),使用每个性别分别以及合并的数据,在独立测试集上进行性能验证。结果表明针对每个性别定制的EN-GLM超越了在合并性别数据集上训练的通用模型,实现了持续更高的性能(图6d, e)。为了识别哪些rsFC特征在预测CID状态中可靠,我们计算了模型100次迭代中每个连通性特征的平均绝对载荷权重。与我们较早的发现一致,性别间预测特征存在明显变化:腹内侧前额皮层、内侧扣带皮层和上顶叶皮层在男性模型中突出,而前扣带皮层、外侧颞皮层和视觉皮层在女性模型中显著(图6f)。

讨论

    女性性别是失眠的重要危险因素,在诊断异质性中发挥作用,但其背后的神经生物学机制仍不清楚。我们的研究从三个主要方面推进了对慢性失眠障碍(CID)神经生物学机制的理解。首先,我们的发现揭示了CID与默认模式网络(DMN)内的性别特异性连接差异以及五个因其失眠遗传易感性而闻名的感兴趣区域(ROIs)相关,这些区域也是潜在的治疗靶点。其次,我们的发现强调了与突触传递、离子通道和免疫信号传导相关的特定基因可能通过改变特定ROIs的连接性来潜在地影响该障碍的病理生理学。第三,我们的发现证明了静息态功能连接(rsFC)的性别差异在统计学上显著且生物学上有影响,这通过基于不同性别组成的不同结果以及使用性别特异性连接数据改善的诊断性能得到证实。总的来说,这些见解揭示了与CID相关的功能网络的共同和性别特异性改变,为理解病理生理学提供了分子基础,并指导基于fMRI的诊断和治疗方法。

    DMN低连接性,常见于失眠的静息态fMRI研究中,但并非所有研究都如此,作为神经刺激的潜在靶点出现,然而rsFC的性别差异历来被忽视。我们对CID患者DMN内rsFC及其与其他网络相互作用的全脑分析显示,DMN低连接性主要发生在男性中,影响后扣带皮层和腹内侧前额叶皮层等关键区域。相比之下,患有CID的女性在非DMN区域显示出增加的rsFC,如上顶叶、内侧扣带皮层和视觉皮层。重要的是要注意,观察到的CID男性和女性之间连接性的变化不能归因于症状严重程度的差异,因为两性都表现出相当的临床症状水平。这表明所识别的不同连接模式可能反映了男性和女性CID的不同潜在机制,男性患者中连接性降低更普遍,女性患者中连接性增加更普遍。我们的发现突出了失眠障碍中性别特异性连接模式,表明男性和女性CID病理生理机制的根本差异。

     全基因组关联研究已经揭示了超过202个与956个基因相关的遗传变异,这些变异增加了失眠的风险,尽管它们对该障碍病理生理学的交互作用仍有待充分理解。新兴证据表明,遗传变异和区域基因表达差异可以显著影响功能网络的组织。这项研究专门探索了失眠研究中已知遗传易感性的五个区域:背外侧前额叶皮层、前扣带皮层、伏隔核、尾状核和壳核,这些区域此前尚未进行性别特异性效应分析。我们的分析表明男女之间存在不同的连接模式,男性通常经历低连接性,女性在这些区域内经历高连接性。在背外侧前额叶皮层,患有CID的男性显示出与多个脑区的连接性降低,包括内侧前额叶、颞极和内侧扣带皮层——这些效应在女性中明显缺失。此外,在其他ROIs如伏隔核、前扣带皮层、尾状核和壳核中,观察到的大多数效应也是性别特异性的,只有很小的百分比(5.5-8.0%)在男性和女性之间共享。

     这些遗传易感区域不仅对理解失眠的神经解剖学至关重要,而且也代表了经颅电刺激和重复经颅磁刺激(rTMS)等治疗方式的关键靶点,这些方法在症状管理中显示出疗效。例如,背外侧前额叶皮层是TMS技术的关键部位,该技术在调节神经过度兴奋性和缓解失眠症状方面显示出前景。同样,前扣带皮层在情绪处理和调节中的作用,已成为治疗情绪障碍的TMS治疗靶点,而情绪障碍常与失眠共存,表明其在失眠治疗中的潜在用途。此外,伏隔核和尾状核是大脑奖赏系统的组成部分,已被探索作为治疗成瘾行为的深部脑刺激靶点,这些行为与失眠共享神经通路,表明它们在失眠治疗中的相关性。然而,据我们所知,尽管在上述ROIs中男性和女性CID患者之间存在明显的、有时相反的连接模式的明确证据,但考虑性别特异性治疗策略的研究有限。我们的结果强调了在研究和治疗方法中将性别作为基本因素纳入的必要性。

     在上述五个检查区域中,CID导致连接模式的特定改变,这在男性和女性之间有所不同。我们提出这些rsFC差异可能由基因表达的区域变异来解释。为了研究这一点,我们将Allen人脑图谱的标准基因表达数据与Glasser功能分区对齐。我们的方法论旨在识别具有显著区域表达(Z分数 > 3或 < -3,pFDR < 0.05)的基因,这些基因可以解释在CID中观察到的连接变异,而不关注性别偏向表达,因为AHBA数据的限制。我们的发现表明,这些区域中独特的基因集解释了男性和女性CID中看到的不同连接模式。值得注意的是,在女性的背外侧前额叶皮层、壳核和尾状核以及男性的背外侧前额叶皮层中,发现了与特定ROIs中rsFC变化相关的显著稳健和可重现的关联。与我们的预测一致,所识别的基因集在脑区域和性别之间都表现出变异。例如,在女性中,某些基因与尾状核和壳核的连接性呈正相关,但与DLPFC区域呈负相关,展示了连接差异的性别特异性遗传贡献。此外,我们发现这些基因集与突触功能、离子通道和免疫信号传导显著相关,这与之前关于失眠和其他精神疾病的GWAS研究的见解一致。这些发现架起了理解CID中rsFC改变及其分子基础之间的桥梁。

    此外,三个基因(ZDHHC2、VAT1L和CHST1)被发现是跨性别和三个ROIs与CID相关的rsFC变化的共同基因。这些基因参与关键的生物过程,如蛋白质修饰、囊泡转运和细胞间信号调节,所有这些对维持正常大脑功能都至关重要。例如,ZDHHC2在蛋白质棕榈酰化中发挥作用,这种修饰对神经递质受体和突触蛋白的膜定位至关重要。由于神经递质信号的正确传递对维持睡眠-觉醒平衡至关重要,ZDHHC2的功能障碍可能间接损害神经元信号传导和脑区域之间的功能连接。鉴于失眠是一种受神经递质调节、神经元可塑性和神经内分泌过程等因素影响的复杂睡眠障碍,这些共同基因的异常可能导致睡眠质量和模式的改变。此外,我们的结果显示GWAS基因列表和我们PLS模型的基因列表共享额外的GO生物过程,特别是那些与大脑发育和行为相关的过程。这些发现强调了失眠复杂的遗传基础。

    总的来说,我们上述的发现突出了DMN和五个遗传易感ROIs中显著的性别特异性rsFC偏差,以及从分子角度解码连接变化。为了评估这些观察到的性别差异如何影响未来研究,我们进行了两项关键分析。首先,针对由于不同性别组成而在之前的失眠rsfMRI研究中看到的变异性,我们调查了rsFC性别差异的影响,特别关注DMN连接性。我们的分析表明,女性比例较高的样本显示出DMN高连接性的显著增加,表明这种性别差异不仅是可观察的,而且具有实质性的生物学相关性,可能解释了早期研究中看到的变异。其次,在对精确诊断失眠亚型和指导治疗的fMRI生物标志物精细化日益增长的兴趣中,我们利用弹性网正则化广义线性模型根据rsFC辨别失眠状态,分析了性别分离和组合连接数据。性别特异性模型在AUC方面优于混合性别模型,并识别出预测CID的独特连接模式。这提供了证据表明rsFC的性别差异能够预测失眠状态,且具有足够的权重来显著增强诊断性能,强调了它们在未来诊断框架中的重要性。

局限性

     我们的研究存在几个局限性:

     首先,rsFC受到各种因素的影响,如生理差异、突触连接的神经生物学变化[88]和一些心理社会因素。我们的数据不能确定观察到的性别差异主要是由于生物学、心理社会或两者的混合。

    其次,认识到DMN连接问题并非失眠独有是至关重要的。DMN功能障碍在众多神经精神疾病中有所不同,如阿尔茨海默病、自闭症和精神分裂症。未来的研究对于确定我们的CID相关发现是否独特以及分子和网络水平的类似机制是否影响其他神经精神疾病至关重要。

    第三,虽然Allen人脑图谱为神经影像结果的分子基础提供了见解,正如其在之前研究中的广泛应用所证明的,但其局限性源于其依赖于来自有限的六个供体组(包括五名男性和一名主要是中年女性)的脑组织样本。这种样本大小限制了皮层基因表达个体变异性的代表性,并阻碍了在我们的PLS回归模型中包含基因表达的性别差异。

    第四,我们的研究没有将年龄作为ANOVA中的协变量,因为组间年龄差异很小且无统计学意义。未来的研究可能考虑将年龄作为协变量来进一步验证我们发现的稳健性,特别是关于潜在的年龄相关效应。

    第五,鉴于DMN功能障碍在许多神经精神疾病中常见,我们的研究没有包括与其他疾病的直接比较。具有协调神经影像和组学数据集的未来跨诊断研究对于分离共享与疾病特异性机制至关重要。

   最后,PLS回归模型本质上建立基因表达和连接变化之间的相关性,而非因果关系。然而,它们正在成为系统神经科学中的强大工具,能够推断皮层中宏观神经影像表型与微观基因、细胞和神经递质表达模式之间的复杂关联。这些模型促进了潜在机制的可测试假设的发展,用于未来的实证验证。

结论

      我们的研究识别了男性和女性之间DMN和五个ROIs内显著的rsFC变化,突出了遗传易感ROIs在基于性别的治疗干预中的潜力。此外,通过利用神经影像和基因表达数据,我们的结果表明与突触传递、离子通道和免疫信号传导相关的基因可能通过影响特定ROIs的功能连接性来影响病理生理学。此外,我们的分析证实rsFC的性别差异不仅在统计学上显著,而且在生物学上有意义,这通过跨性别组成的不同结果和使用性别特异性连接数据改善的诊断准确性得到证实。这些发现揭示了CID相关功能网络的共同和性别特异性改变,为潜在生物标志物提供信息并指导基于fMRI的治疗策略。

原文:Molecular mechanisms explaining sex‑specific functional connectivity changes in chronic insomnia disorder