植物内生菌与植物的营养吸收密切相关,深入理解植物根系与内生菌之间的互作关系可为改善植株的磷营养提供新思路。本文作者对 50 个磷吸收敏感性差异显著的甘蓝型油菜( Brassica napus L. )核心种质的侧根与内生菌之间的互作进行了系统表征。通过分析油菜侧根中内生细菌丰度与植物生理指标之间的相关性,并结合平板和土壤接种实验,作者成功分离并鉴定出一株能够显著缓解油菜缺磷表型的 Flavobacterium 菌株( C2 )。进一步通过加权基因共表达网络分析( WGCNA )和以 Flavobacterium 丰度为数量性状的全基因组关联研究( GWAS ),探讨了其潜在的作用机制。在低磷条件下, C2 通过调节脂肪酸和脂质代谢途径发挥作用,例如改善了亚油酸代谢,促进了亚油酸介导的油菜根系木栓质生物合成,从而提升了植株的磷吸收效率。此外, C2 还能够抑制根中依赖于 α- 亚麻酸代谢的茉莉酸生物合成,从而改善 C2 的根系定殖并激活磷吸收途径。该研究表明,通过调控植物内生菌群落的组成,可有效改善甘蓝型油菜的磷营养,为开发新型农业微生物制剂提供科学依据。
一、 50 个核心油菜品种对低磷响应的农艺性状相关表达模块的鉴定
作者首先从 991 份油菜资源中筛选出在遗传多样性上差异较大的 272 个品种,并将其种植在低磷和正常磷条件下的四个地块中(每个品种种植 50 株)。在不同生态型(春性、半冬性、冬性)品种的低磷处理和对照处理下,通过观察幼苗阶段的表型差异,最终选取了 50 个表现稳定的品种用于后续分析。
研究者对这些品种在低磷( LP )和正常磷( CK )条件下进行了对照处理,并采集其侧根样本用于转录组分析。结果显示,低磷条件显著降低了油菜地上部分的磷含量( P )、植株干重( SD 和 RD )以及土壤到植株的磷吸收率( ABS )。转录组分析进一步揭示,这些核心品种在低磷条件下的根系表现出显著的响应差异,不同生态型之间的反应模式也存在显著差异。基因本体( GO )富集分析显示,低磷条件下差异表达基因( DEGs )在磷离子转运和磷饥饿响应等生物过程中显著富集。通过加权基因共表达网络分析( WGCNA ),研究者将基因表达模块与农艺性状(如植株干重、根重和磷吸收率)进行关联,最终确定了 7 个关键模块,这些模块主要富集于磷酸盐运输、酮体响应以及糖脂代谢等关键生物过程中。
图 1 与缺磷( P )相关的差异表达基因( DEGs )的鉴定
a. 油菜( Brassica napus L. )根系的多数据集整合分析。 b. 三种生态型在正常和缺磷条件下的地上部干重( SD )、根干重( RD )、总磷含量( P )以及磷从土壤到地上部的吸收率( ABS )箱线图。 c. 基于差异表达基因的 399 个样本的前两个主成分( PC1 和 PC2 )的 PCA 图。 d. 与磷限制相关的三种生态型中 DEGs 的基因本体( GO )富集分析(左),以及与磷饥饿响应和磷转运相关的核心 DEGs 表达的热图表示(右)。 e. 模块 – 性状相关性分析。 f. 对紫色、深红色、绿色、橙红色、浅绿色、深橄榄绿或黄绿色模块中的基因进行 GO 富集分析。
二、侧根中的微生物共现性网络互作
作者通过对油菜侧根进行 16S rRNA 测序,共鉴定出 38,876 个扩增子序列变体( ASVs ),隶属于 545 个科和 1,377 个属。主坐标分析( PCoA )和 Beta 多样性差异分析表明,不同生态型(春性、半冬性、冬性)油菜在磷限制条件下的响应存在显著差异。在低磷环境中,黄杆菌属( Flavobacterium )、假节杆菌属( Pseudarthrobacter )和嗜麦芽窄食单胞菌属( Stenotrophomonas )的丰度平均降低,而未分类的丛毛单胞菌科( unclassified_f__Comamonadaceae )、原小单孢菌属( Promicromonospora )和泛菌属( Pantoea )的丰度显著增加。进一步分析发现,黄杆菌属的丰度与油菜地上部总磷含量呈显著正相关,而未分类的丛毛单胞菌科和原小单孢菌属的丰度则与总磷含量呈显著负相关。此外,黄杆菌属是唯一在三种生态型中丰度变化趋势一致的细菌属。对丰度最高的 17 个细菌属进行相关性分析后,作者构建了它们在根部的互作网络。在正常磷( CK )和低磷( LP )条件下,分别检测到 46 个(其中黄杆菌属有 4 个)和 48 个(其中黄杆菌属有 6 个)显著相关性。
通过相关性分析,研究确定了 12 个与黄杆菌属丰度显著相关的基因表达趋势模块。其中,浅绿色模块和深橄榄绿色模块均与黄杆菌属丰度及四个关键生理指标(地上部干重 SD 、侧根干重 RD 、磷含量 P 、吸收速率 ABS )显著相关。浅绿色模块中的基因(如 4- 香豆酸 – 辅酶 A 连接酶 [4CL] )在低磷条件下显著下调,参与苯丙烷类生物合成和 α- 亚麻酸代谢途径;深橄榄绿色模块中的基因(如丙酮酸激酶 [PK] )在低磷条件下表达水平显著上调,富集于糖酵解过程。
图 2 缺磷对根际微生物多样性的影响
a. 基于标准化 ASV 丰度的 beta 多样性差异分析结果。 b. CK 和 LP 样本中 17 个最丰富细菌属的相对丰度(平均值)。 c. 细菌科水平与地上部磷含量的相关性分析。 d. 基于相关性分析鉴定与黄杆菌丰度和四种表型(地上部干重( SD )、侧根干重( RD )、磷含量( P )和吸收率( ABS ))均相关的模块。 e. 基于 RNA – seq 数据的与苯丙烷类生物合成和糖酵解过程相关的核心差异表达基因( DEGs )表达水平的热图表示。
三、核心Flavobacterium内生菌株的分离
作者从油菜侧根中纯化并鉴定了 4 株黄杆菌内生菌( L2P42D4 、 L2P42H1 、 L2P02C2 和 L2P24B9 )。通过平板接种实验发现,其中部分菌株能够显著提高油菜地上部或根部的鲜重,其中 L2P02C2 (简称 C2 )表现出显著缓解磷饥饿对油菜( ZS11 )营养生长抑制的能力。扫描电子显微镜观察显示, C2 能够附着于 ZS11 侧根表面,并在根中柱区域成功定殖。进一步研究表明, C2 具有溶磷活性,可通过降低液体培养基的 pH 值实现磷的溶解,但不具有钾溶解和固氮能力。此外,作者构建了 C2 的高质量基因组序列,揭示其基因组中包含参与多种代谢反应的基因,且存在与柔红素生物合成相关的基因簇。基于 16S rRNA 数据的分析,作者研究了与 C2 相关的 ASVs 丰度及其与其他菌株的关系,结果表明,具有相似功能的菌株是油菜根内生黄杆菌种群的重要组成部分。
图 3 与磷饥饿响应相关的核心黄杆菌的分离
a. 在对照( CK )、低磷( LP )以及接种了四种黄杆菌菌株之一的 LP 培养基上 ZS11 发芽后 7 天的生长状况 b. 在 Mock (左)或接种 C2 后(右)生长的 ZS11 侧根表面的扫描电子显微镜图像。 c. C2 在 ZS11 根中的定殖模式 d. 黄杆菌 C2 在 Pikovskaya 固体培养基上的溶磷晕圈以及在 Pikovskaya 液体培养基中培养时的 pH 变化趋势。 e. 基于 KEGG 注释的与代谢相关的基因数量的黄杆菌 C2 饼状图。 f. 关键化合物生物合成簇或代谢途径示意图。
四、Flavobacterium C2的功能特征描述
对 ZS11 和 6 个代表性油菜品种进行土壤培养实验发现,在低磷( LP )条件下,不同品种的鲜重下降幅度存在差异,其中低磷敏感品种的变化更为显著。接种 C2 后,各品种的鲜重均有所增加,尤其在 R5149 中表现突出。此外, ZS11 和 R5149 的平板实验结果也表明,接种 C2 显著促进了植株的生长。这表明 C2 通过根系定殖能够缓解磷限制条件下的生长抑制效应,对低磷敏感品种的作用尤为明显。以 ZS11 为材料开展准靶向代谢组分析,主成分分析( PCA )显示,接种 C2 显著改变了油菜幼苗在低磷胁迫下的代谢物组成。 KEGG 通路富集分析表明,在 LP 条件下,接种 C2 导致部分代谢物丰度下降,同时促进了苯丙氨酸等物质的水平提升及相关生物合成过程。接种 C2 还显著增加了根部蔗糖的积累,使中间代谢物进一步进入三羧酸循环( TCA 循环)或相关代谢途径。卢戈氏溶液染色实验结果显示,在 LP 样品中, ZS11 侧根尖端淀粉积累明显高于 CK 和 LP + C2 样品。 RT-qPCR 分析验证了五个关键基因的表达模式:浅绿色模块中的 GMD1 基因在低磷条件下受到抑制,而深橄榄绿色模块中的四个基因在 LP 条件下表达水平显著上调,且接种 C2 进一步加剧了这些基因的表达变化。结果表明,接种 C2 能够减少油菜根在低磷条件下的淀粉积累,促进底物进入 TCA 循环,从而缓解低磷胁迫对植株生长的负面影响。
图 4 黄杆菌 C2 的功能鉴定
a. 在接种或未接种 C2 的土壤中种植的 ZS11 和其他 6 个核心油菜品种的地上部或根部鲜重的统计结果。 b. 在接种或未接种 C2 的土壤中种植的 21 天龄 ZS11 和 R5149 植株的生长状况。 c. 在接种( C2 )或未接种(模拟对照) C2 的无菌 1/2 MS 培养基上, R5149 和 ZS11 (发芽后 7 天)的生长状况。 d. 基于图 4b 中根样本的差异丰富代谢物的主成分分析( PCA )图。 e. 土壤培养材料中糖酵解途径核心基因(基于实时荧光定量 PCR ( RT – qPCR )结果。 f. 用卢戈氏溶液对 ZS11 侧根尖端进行淀粉质体染色及淀粉质体数量 。
五、鉴定和验证与脂质代谢介导的木栓质和茉莉酸生物合成相关的核心基因
对黄杆菌 ASV 丰度变化进行全基因组关联分析( GWAS )共鉴定出 221 个基因,其中包括参与木质素和木栓质生物合成及茉莉酸( JA )信号通路的关键基因,例如 ABCG2 、 CYP86B1 、 KCS20 和 JAZ13 ,且有两个基因与加权基因共表达网络分析( WGCNA )中浅绿色模块的基因重叠。研究进一步筛选了 9 个与相关生物合成途径密切相关且受低磷处理和 C2 接种影响的基因(如 PAL2 、 CYP73A5 等),通过 RT-qPCR 验证发现,在低磷( LP )条件下,这些基因的表达水平普遍下降,而接种 C2 可提高部分基因的表达水平。通过测定相关代谢途径中关键化学物质的含量,研究发现低磷条件下油菜中茉莉酸( JA )积累显著增加,而部分代谢中间产物减少。接种 C2 后,某些代谢物的含量发生改变,例如松柏醇和对香豆醇含量增加,而其他物质含量则降低。在低磷条件下,油菜根部木栓质沉积减少,木质化水平和 JA 积累增加;然而,接种 C2 能够恢复木栓质的生物合成和运输,同时缓解 JA 生物合成,调节相关代谢物的分布,从而可能提高磷吸收效率并促进油菜的生长。此外, C2 基因组注释显示其包含与 JA 生物合成途径相关的两种关键限速酶基因:乙酰辅酶 A 氧化酶( ACX )和乙酰辅酶 A 酰基转移酶( ACAA )。在低磷条件下,接种 C2 显著降低了 ACX2s 和 ACAA2s 的表达水平。进一步实验表明,在低磷平板上接种 C2 能有效促进油菜根的发育,而额外施用外源茉莉酸甲酯( MeJA )显著抑制了模式植物 Col-0 和 acx2-1/3-6 突变体幼苗的根发育。综上所述,在磷限制条件下, C2 通过调节油菜根部木栓质的分布并抑制 JA 的过量生物合成,改善了根系对磷的吸收效率和植物的营养生长。
图 5 黄杆菌 C2 对油菜脂肪酸代谢的影响
a. 基于全基因组单核苷酸多态性( SNPs ),黄杆菌在低磷( LP )相对于对照( CK )中扩增子序列变体( ASV )丰度变化的关联信号曼哈顿图。 b. 与 α – 亚麻酸代谢介导的根茉莉酸合成相关的土壤培养材料中关键代谢物含量(基于代谢组数据)和核心基因表达水平(基于实时荧光定量 PCR 变化的热图。 c. ZS11 第三侧根中木栓化区域的不同沉积情况。 d. 茉莉酸( JA )和脱落酸( ABA )含量。
在低磷条件下,油菜幼苗会减少其根部木栓质的沉积,以促进根部对磷的吸收。然而,显著升高的木质化水平以及茉莉酸( JA )、淀粉和其他产物的积累,限制了低磷条件下侧根的伸长。解磷细菌 C2 能够向土壤中释放有机酸,以增强磷的溶解性并增加土壤中无机磷酸盐( Pi )的含量。此外, C2 重构了根部由α – 亚麻酸代谢介导的 JA 和木栓质生物合成网络,这改善了 C2 的定殖情况以及油菜的营养生长(图 6 )。
图 6 黄杆菌 C2 介导的植物生长和土壤改良的假设模型。
溶磷细菌 C2 能够通过介导油菜( Brassica napus L. )根系脂质的再分配,有效缓解低磷环境中营养生长的限制。
论文信息
原名: Multiomics dissection
of Brassica napus L. lateral roots and endophytes interactions
under phosphorus starvation
译名: 磷饥饿条件下甘蓝型油菜(Brassica
napus L.)侧根与内生菌互作的多组学解析
期刊: Nature Communications
DOI:10.1038/s41467-024-54112-5
发表时间:2024年11月
通讯作者:Peng Yu, Daojie Wang, Xinping Chen & Nannan Li
通讯作者单位: Crop Functional Genomics, Institute of Crop Science and Resource Conservation, University of Bonn, Bonn, Germany;College of Agriculture, State Key Laboratory of Crop Stress Adaptation and Improvement, Henan University, Southwest University