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组织标本的制备要求：建立标准化的HER2检测全流程。未染色的切片置于室温不宜超过6周，所有乳腺癌标本离体后都应及时、充分固定，固定时间以6~72 h为宜。骨转移标本建议使用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液（证据质量：高；推荐强度：强）。

常规HER2检测推荐标本类型为：手术切除标本；微创旋切标本；粗针穿刺活检标本；大于100个癌细胞的细胞学标本/蜡块。由于冷缺血时间过长会导致HER2显色减弱，建议所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内）。一项研究^[2]旨在评估冷缺血时间对浸润性乳腺癌HER2 IHC检测结果的影响，结果表明，随着冷缺血时间的延长，HER2染色强度减弱，特别是在4小时和8小时时，染色质量下降明显。该研究揭示了冷缺血时间对乳腺癌HER2 IHC评估的影响，凸显了操作流程标准化的必要性。

另一项研究^[3]发现，对于冷藏样本，显著的染色减少通常在4小时后出现，而对于室温下的样本则在2小时后出现。研究支持将冷缺血时间控制在1小时内，以确保生物标志物检测的准确性。

图1. 不同冷缺血时间对HER2 IHC染色的影响

固定时应将标本每隔5-10 mm切开，在组织间嵌入纱布或滤纸等物，固定液与所浸泡组织的比例应足量。根据标本大小，固定时间以6~48h为宜，最好不超过72h。一项前瞻性研究^[4]旨在评估固定时间超过72小时对乳腺癌样本中ER、PR和HER2表达的IHC检测的影响。研究发现，未冷藏样本（室温下）比冷藏样本更容易受到冷缺血时间延长的影响，这表明在室温下固定时间对生物标志物检测的影响可能更大。

图2. 分别经短期固定和长期固定的乳腺癌样本中的IHC评分分布情况

与此同时，HER2低表达肿瘤细胞膜染色不完整、着色程度较弱，以及缺乏充分固定或过长的冷缺血时间更容易影响到其IHC染色的镜下表现^[5]，因此，指南对标本的固定时间建议以6-72小时为宜。

固定液的选择可能会影响HER2检测结果，一项研究^[6]审查了来自60个国家的8000多个临床试验点的117,636个肿瘤样本，分析了在真实世界中，除了标准10%中性缓冲甲醛（NBF）外，其他固定液的使用情况。结果显示，7.8%的样本使用了替代固定剂。尽管在细胞系中，不同固定液的HER2检测结果完全一致。但在肿瘤组织中，不同固定液的一致性略有下降，尤其是在阳性样本中。因此，在进行HER2检测时，选择合适的固定液非常重要。指南建议固定液类型选择3.7%中性（磷酸盐缓冲）甲醛固定液。

图3. HER2 IHC 3+乳腺癌组织经10% NBF、20% NBF和10% UBF固定后的HER2 IHC染色图像（放大40倍）

用于IHC染色的切片厚度以3-5 μm为宜，原位杂交法以4-5 μm为宜。过薄可导致假阴性，过厚可导致假阳性和组织脱片。

图4. 不同切片厚度对HER2显色的影响

白片保存时间同样会影响HER2状态的诊断，一项研究^[7]旨在评估石蜡切片保存时间对乳腺癌组织中HER2表达水平的影响。研究设计包括240例浸润性乳腺癌病例，其中128例为手术标本的石蜡切片，并将112例制作成组织微阵列切片以模拟活检组织。结果显示，随着保存时间的增加，HER2表达水平逐渐降低，特别是在HER2低表达的患者中。此外，与手术标本相比，活检组织的HER2表达水平下降更快，其中HER2 2+的切片变化率最高，而HER2 3+的切片HER2表达最稳定。因此为防止抗原丢失，指南建议未染色切片置于室温不宜超过6周。此外，鉴于HER2低水平表达病例对应白片中的HER2抗原不稳定性增加，并且白片保存的温度、湿度也可能一定程度影响HER2抗原的检测，所以，白片应尽量在低温低湿环境下保存，并尽快进行HER2检测。

图5. 白片保存时间对HER2低表达影响明显

指南推荐骨转移标本，区分肿瘤的质硬/软区域进行分别处理，分离组织分别按常规流程处理，其中质硬骨组织标本建议使用EDTA脱钙液，以减轻脱钙液对转移标本HER2检测的影响。骨转移标本固定及脱钙时间与组织大小、厚度、质地相关。相关研究表明^[8]，脱钙处理显著降低了乳腺癌样本中HER2 IHC 1+和IHC 2+染色质量。鉴于发生骨转移的转移性乳腺癌HER2状态的评估可能受到脱钙的影响，需要选择适宜的脱钙液。

酸性脱钙液（如硝酸、盐酸等）脱钙速度快，但会对组织和细胞产生一定程度的破坏作用，造成抗原、核酸的破坏和丢失，进一步影响形态学观察、免疫组织化学染色及基因检测。EDTA脱钙液通过螯合作用脱钙，相比酸性脱钙液而言，脱钙作用相对温和，对组织学形态及抗原保存好，对RNA/DNA损伤小，有利于乳腺癌骨转移患者的标本检测需求。一项研究^[9]表明，经RapidCal脱钙液和EDTA处理的标本在形态学和IHC染色上表现较好，明显优于硝酸处理组。而经硝酸处理的标本染色效果较差，核抗原和HER2蛋白的表达丢失严重。因此，指南推荐骨转移标本使用EDTA脱钙液。

图6. 硝酸组(图A、D、G)、EDTA组(图B、E、H)和RapidCal组(图C、F、I) HE、HER2 IHC和FISH效果比较；图A-C为HE染色，中倍放大；图D-F为HER2 IHC染色，中倍放大；图G-I为FISH法，高倍放大

染色过程中的质量控制：设立一组不同染色梯度的外对照，有条件单位建议同时设立 0、1+、2+和 3+。检测方法的开展需要通过严格的比对验证，并建议定期参加相关外部质量控制活动来实现（证据质量：高，推荐强度：强）

指南建议抗体选择应经过国家药品监督管理局（NMPA）认证，并经过充分对比验证。应针对实验室新使用或新批次抗体进行验证，选取与本单位原位杂交结果一致性更好的抗体，也可通过参加有关外部质量控制活动（建议每年进行1-2次）来实现。

但在实际临床实践中，即使是相同的检测方法，采用不同的染色参数也可能影响最终的HER2检测结果，特别是在HER2低表达乳腺癌样本中。一项多中心研究^[10]旨在评估不同染色参数对HER2低表达乳腺癌样本中HER2 IHC结果的影响。研究涉及19个实验室，这些实验室使用相同的检测方法（PATHWAY 4B5抗体和BenchMark平台）对HER2进行染色。研究收集了关于染色过程中各种参数（如脱蜡温度、抗原修复条件等）的详细信息，并由专家小组对染色结果进行评估。结果显示，在19个实验室中，仅有2个实验室完全遵循了FDA推荐的染色条件。对于部分病例，19个实验室的评分与初始评分完全一致，一致性达到100%。然而，对于HER2 1+的两个病例，分别有21.1%和31.6%的实验室结果与初始评分不一致，大多数切片被判读为HER2 0。该研究强调了在实际应用中需要对相关染色参数进行严格控制。

图7. 不同机构在进行HER2 IHC评分时的一致性结果

此外，在染色操作方面，指南建议HER2 IHC检测需设立外对照。建议细化HER2染色梯度对照的设立，更有利于病理医师在判读时对膜染色强度的区分，验证IHC染色的灵敏性和准确性。推荐有条件单位对照设置包含0、1+、2+和3+不同评分的乳腺癌组织芯片或细胞系，以提供更全面细致的质量控制。建议定期统计分析不同IHC评分的阳性率，监测偏倚状态，从宏观上进行质量控制。