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结果：
共识聚类基于 IEG 确定了 HCC 的两个不同亚组
图1 显示了作者研究的详细流程图。作者收集了 182 个先前报告的 IEG。根据 TCGA 数据库中 HCC 患者的数据，与邻近肝组织相比，18 个 IEG 在 HCC 中高表达。 2 使用基于 18 个 IEG 的无监督聚类分析，作者在 TCGA 队列中确定了两个集群（IEG 集群 1 和 IEG 集群。主成分分析 （PCA） 显示两个集群之间 IEGs 表达存在显著差异。然后，作者分析了聚类分类与分子病理特征之间的相关性。卡方检验显示，IEG 集群 2 与较高的 AFP 水平 （< 400 μg/L） 和更晚期的肿瘤病理分级 （III-IV 级;无花果。 2 Kaplan-Meier 曲线和对数秩检验进一步显示，与 IEG 集群 1 的患者相比，集群 2 患者的 OS 明显更差。 2 KEGG 分析表明，第 2 簇中几种肿瘤相关通路显著富集，包括 NOTCH 和 mTOR 信号通路。值得注意的是，免疫相关通路在两个集群之间也表现出显著差异进一步揭示了免疫相关通路的两个集群之间的显着差异，例如趋化因子的产生、调节性 T 细胞分化、参与免疫反应的髓样细胞激活以及免疫反应的负调节这表明 IEG 第 2 组患者可能处于免疫抑制状态。
HCC 的 IEG 集群的集群。（A）高表达 IEGs 的火山图。（B）基于 18 个 IEG 对来自 TCGA 队列的 HCC 患者进行共识聚类。（C）累积分布函数（CDF） 图表明曲线在 K = 2 时保持相对平坦。K 和 K-1 之间 CDF 曲线下面积的相对变化表明，在 K 值为 2 和 3 之后，斜率变化更明显。因此，选择 K = 2 作为最佳聚类数。（D）显示了两个集群的 IEGs 表达热图以及临床特征。（E） PCA 图说明了两个 IEG 集群之间的聚类。（F）显示 IEG 集群 1 和 IEG 集群 2 之间 KEGG 通路差异的热图。（G）描绘了两个集群的生存曲线。（H） IEG 集群 1 和 IEG 集群 2 之间免疫相关途径的差异。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001
然后作者使用 ssGSEA 比较两个集群之间的免疫细胞浸润以进行免疫分析。箱形图显示，与 IEG 簇 1 相比，IEG 簇 2 中活化的 CD4+ T 细胞、活化的 DC、髓源性抑制细胞 （MDSC）、Treg 和 2 型辅助性 T 细胞（Th2 细胞）的浸润增加（图 2）。 3 A）. 活化的 CD4 + T 细胞与抗肿瘤反应的启动有关;然而，它们的慢性激活会导致免疫衰竭，从而抑制 TME 内的免疫反应。此外，它们可以分化成 Th2 细胞和 Tregs，它们在肿瘤内发挥免疫抑制作用 [ 17 ]。DC 被认为是 TME 的核心组成部分，能够促进抗肿瘤反应。然而，这些细胞的一个特定亚群，浆细胞样树突状细胞 （pDC），可以通过表达免疫抑制分子（如 PD-L1、ICOSL 和吲哚胺 2,3-双加氧酶）或促进 Tregs 的扩增来促进肿瘤生长 [ 18 ， 19 ]。MDSC、Tregs 和 Th2 细胞都与促进肿瘤进展有关。它们在肿瘤中建立转移前生态位、刺激血管生成和增强免疫逃避机制中发挥作用 [ 20 – 23 ]。这些结果表明 IEG 集群 2 中的 HCC 患者存在潜在的免疫抑制微环境。使用 CIBERSORT 的分析进一步证实了这一推论。在第 2 簇中，活化记忆 CD4+ T 细胞、滤泡辅助性 T 细胞（Tfh 细胞）、Treg 和巨噬细胞的浸润增加，而 B 细胞和 NK 细胞减少（图 2）。 3 B）. 在 B 细胞淋巴瘤中，Tfh 细胞通过分泌细胞因子调节 TME，从而促进肿瘤进展 [ 24 ， 25 ]。此外，作者发现 Tfh 细胞、Tregs 和 M0 巨噬细胞的浸润与大多数 IEGs 的表达呈正相关。 3 值得注意的是，几种算法都证明了 Tregs 浸润的差异。大量研究表明，Tregs 在肿瘤中发挥免疫抑制作用并促进其进展 [ 26 – 28 ]。因此，作者推测 Tregs 有助于 IEG 集群 2 患者 HCC 的免疫抑制微环境和免疫逃避。此外，作者使用 GSEA 计算了免疫细胞浸润和免疫相关通路的两个簇之间的差异（图 2）。 3 D， E） 的在 IEG 第 2 组患者的 TIME 中，作者观察到 aDC 、 iDC 和 Tregs 的浸润增加，同时 NK 细胞和巨噬细胞浸润减少。在免疫相关通路方面，作者惊讶地发现 IEG 集群 2 患者在 MHC I 类通路和 HLA 通路中的表达增加，这通常被认为可以增强肿瘤免疫力。然而，与此同时，II 型 IFN 反应通路的表达也增强。目前的研究表明，肿瘤细胞可能通过 IFN-γ 信号通路增加 PD-L1 的表达，从而抑制 T 细胞的活性，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击 [ 29 ， 30 ]。总的来说，IEG 对 HCC 的 TME 产生重大影响。 基于 IEG 谱的患者分层揭示了不同的免疫学景观，其特征是 HCC 内不同程度的免疫细胞浸润和免疫相关途径的富集，最终导致不同的临床结果。这些发现强调了 HCC TME 内固的异质性以及 IEGs 在其中的关键作用，因此有必要进一步研究 IEGs 在 HCC 背景下的功能意义。
两个 IEG 簇之间免疫细胞浸润和通路富集的差异。（A）使用 ssGSEA 算法分析不同的免疫细胞浸润水平。（B）使用 CIBERSORT 算法分析不同的免疫细胞浸润水平。（C）每个 IEG 的免疫细胞浸润水平差异。（D） GSVA 算法预测的 IEG 簇组之间免疫细胞浸润的差异。（E） GSVA 算法预测的 IEG 簇组之间免疫相关通路的差异。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
为了进一步确定 IEG 中的关键基因，作者首先对 18 个 IEG 应用单变量 Cox 回归分析，发现其中 14 个与 TCGA 队列中 HCC 患者的 OS 显著相关 （p < 0.05） （表 1 ）。随后，通过套索算法分析，作者确定了两个基因（CAD 和 PIGU）用于构建免疫逃避预后特征 （IEPS）的多变量 COX 回归分析显示，CAD 和 PIGU 与 HCC 患者的 OS 独立相关 （p < 0.001）。（图 4 C）。根据该公式，作者计算了 TCGA 队列中 HCC 患者的 IEPS 评分，并根据最佳临界值将 HCC 患者分为高 IEPS 组 （103 例 HCC 患者） 和低 IEPS 组 （267 例 HCC 患者）。图 4 E 显示了患者 IEPS 评分和生存状态的分布（图 E）。 4 Kaplan-Meier 曲线和对数秩检验表明，与低 IEPS 组患者相比，高 IEPS 组患者的 OS 明显更差ROC 曲线表明，IEPS 评分是 OS 的可靠指标，预测 TCGA 队列患者 1 年 OS 的曲线下面积 （AUC） 值为 0.768,2 年 OS 为 0.705,3 年 OS 为 0.683（图 4 F）. 使用 ICGC 队列作为验证集来评估 IEPS 的预后预测能力，作者获得了与 TCGA 队列相似的结果。图 4 G 和 H 表明，与低 IEPS 组相比，高 IEPS 组患者的 OS 明显短。 此外，ROC 曲线表明，IEPS 评分对 ICGC 队列的预后具有极好的预测能力 （1 、 2 和 3 年的 AUC 分别为 0.712、 0.685 和 0.731，p < 0.01） （图 4 I）。PCA 图清楚地显示了两个亚组之间的明显聚类。以上结果表明，IEPS 评分可以准确预测 HCC 患者的预后。
IEPS 的建立和确定。（A-B）Lasso 回归分析显示，对应于最佳 lambda 值的变量数为 2。（C）森林图表明这两个 IEG 与患者 OS 之间的相关性。（D） Kaplan-Meier 曲线显示，在 TCGA 队列中，高 IEPS 组患者的 OS 显著变差。（E） TCGA 队列中 HCC 患者的 IEPS 评分和生存状态分布。（F） IEPS 预测 TCGA 队列 1/2/3 年生存率的 ROC 曲线。（G） Kaplan-Meier 曲线显示，在 ICGC 队列中，高 IEPS 组患者的预后显著变差。（H） ICGC 队列中 HCC 患者的 IEPS 评分和生存状态分布。（I） IEPS 预测 ICGC 队列 1/2/3 年生存率的 ROC 曲线。（J） PCA 图说明了 TCGA 队列中两组 HCC 患者的聚类。（K） PCA 图说明了 ICGC 队列中两组 HCC 患者的聚类
为了探讨 IEPS 评分与 HCC 患者临床病理特征之间的关系，作者分析了随着 IEPS 评分的增加，患者临床特征的变化。热图表明，较高的 IEPS 评分与晚期 TNM 分期、较高的 WHO 分级、较高的死亡率和α胎蛋白 （AFP） 升高相关（图 5 此外，分析显示，女性患者以及 WHO III-IV 级、TNM III-IV 期和高 AFP 水平 （≥ 400 μg/L） 的患者具有较高的 IEPS 评分，在年龄亚组中未观察到显著差异（图 5 B-F）。为了评估 IEPS 对各种 HCC 亚组的预测能力，作者对不同的临床亚组进行了生存分析。作者发现，在 TNM I-II 和 III-IV 组以及 WHOI-II 和 WHOIII-IV、AFP < 400 和 ≥ 400 μg/L、女性和男性以及年龄< 65 岁和 ≥ 65 岁亚组中，高 IEPS 评分与预后较差相关（图 5 G-P）。这表明 IEPS 评分可靠地预测不同临床亚组的 HCC 预后。
IEPS 的临床病理特征和分层分析。（A） TCGA 队列和 ICGC 队列中两种 IEGs 表达水平与临床病理特征之间关联的热图。（B-F） 具有不同临床病理特征 （包括性别、 AFP 水平、WHO 分级、TNM 分期，但不包括年龄） 的患者具有不同水平的 IEPS 评分。（G-P）IEPS 在多个 HCC 患者亚组中保留了其预后价值 （包括男性或女性、WHO III-IV 级或 I-II、TNM III-IV 期或 I-II 期、年龄< 65 岁或 ≥ 65 岁和 AFP < 400 或 ≥ 400 ug/L 的患者）
作者对 TCGA 和 ICGC 队列进行了单变量和多变量 Cox 回归分析，以评估 IEPS 评分作为 HCC 患者独立预后因素的潜力（图 1）。 6 A， B） 的包括年龄、性别、AFP 水平、等级、分期和 IEPS 评分在内的单变量 Cox 分析显示，IEPS 是 OS 的强危险因素 [风险比 （HR）：3.485,95% 置信区间 （CI）：2.336–5.198，p < 0.001]。在多变量 COX 分析中，作者确认 IEPS 是 OS 的独立危险因素 （HR： 3.100,95% CI：2.024–4.748，p < 0.001） 。这一结果在 ICGC 队列中得到了验证 （HR： 5.190,95% CI： 2.417– 11.144，p < 0.001 在单变量 Cox 分析中;HR：3.938,95% CI：1.810–8569，p < 0.001 在多变量 COX 分析中）。
基于 IEPS 的预后列线图的开发和验证。（A）单变量和多变量分析显示，IEPS 评分是 TCGA 队列的独立预后预测因子。（B）单变量和多变量分析显示，IEPS 评分是 ICGC 队列的独立预后预测因子。（C）基于 IEPS 和 TNM 分期的列线图。（D）用于预测 TCGA 队列中 1 、 2 和 3 年 OS 概率的列线图校准图。（E）用于预测 ICGC 队列中 1 、 2 和 3 年 OS 概率的列线图校准图。（F-H） 基于 TCGA 队列中 IEPS 评分和 TNM 分期的列线图的时间依赖性 ROC 曲线（用于预测 1 年、2 年和 3 年 OS）
随后，为了更好地将 IEPS 应用于临床实践，作者开发了基于 IEPS 评分和肿瘤分期的列线图. 校准曲线显示 1 年、2 年和 3 年标记的预测存活率和实际存活率之间具有极好的一致性的 ROC 曲线表明，与 IEPS 相比，列线图对患者预后的预测准确性进一步提高（TCGA 队列中 1、2 和 3 年的 AUC 达到 0.777、0.719 和 0.744，ICGC 队列中 1、2 和 3 年的 AUC 达到 0.834、0.749 和 0.766）。此外，DCA 曲线显示预后列线图对临床应用具有很高的净收益。以上结果表明，作者基于 IEPS 和 stage 开发的列线图具有令人兴奋的预测能力，便于临床应用。
接下来，作者要阐明 IEPS 组的免疫学特征。箱线图和 Sankey 图显示，与 IEG 集群 1 相比，IEG 集群 2 中的大多数 HCC 患者表现出 IEPS 评分升高，并表现出 OS 下降的趋势（图 1）。 7 A， B） 的为了进一步理解高 IEPS 组和低 IEPS 组之间的免疫学差异，使用 GSEA 来确定两个亚组内免疫细胞的浸润和免疫相关途径的富集。在高 IEPS 组中，观察到调节性 T 细胞分化的富集，这意味着存在免疫抑制条件 在低 IEPS 组中，免疫相关通路（如补体激活、经典通路和凝集素通路）主要被激活。这些通路在免疫防御中起着关键作用，表明低 IEPS 组内的免疫反应增强。（图 . 7 此外，作者使用 GSVA 方法检查了高 IEPS 组和低 IEPS 组之间免疫细胞浸润和免疫相关途径的差异。结果显示，与低分组相比，高分组 Tregs 和巨噬细胞的浸润更多，但 NK 细胞和中性粒细胞较少. 在免疫相关途径方面，高 IEPS 组在 MHC I 类和溶细胞活性途径中表达升高，但在 I 型 IFN 反应和 II 型 IFN 反应通路中表达较低（图 7 这些结果进一步表明，高 IEPS 组可能处于免疫抑制状态。
两个 IEPS 亚组的免疫特性。（A） IEG 集群之间 IEPS 分数的差异。（B） IEG 亚型在不同 IEPS 评分和生存状态组中分布的 Sankey 图。（C-D）GSEA 用于揭示在 IEPS 亚组中富集的 IEPS 相关通路。（E）通过 GSEA 分析观察两组免疫细胞浸润的差异。（F）通过 GSEA 分析分析两组间免疫相关通路的差异。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
CAD 和 PIGU 促进 Tregs 在 HCC 中的浸润
肿瘤的发生与免疫微环境密切相关。接下来，为了描述高 IEPS 组的 TIME 景观，作者使用 ssGSEA 来检查 HCC 中与 PIGU 和 CAD 相关的免疫细胞浸润. Pearson 相关分析显示，Tregs 和 M0 巨噬细胞的浸润水平与 PIGU 和 CAD 的表达呈正相关。使用 ICGC 数据集进行进一步验证得出了类似的结论。 8 图 8 C-F 说明了 Tregs、巨噬细胞和 IEPS 评分的表达关系。这表明 Tregs 可能是促进 IEPS 高评分组 TME 免疫逃避的关键免疫细胞，也可能是 HCC 对免疫治疗反应不佳的一个原因，这与作者之前获得的结果一致。此外，作者比较了低 IEPS 组和高 IEPS 组之间几种重要免疫检查点 （ICs） 的表达。包括 PDCD1、CTLA4、TIM-3、CTLA-4、LAG3、TIGIT、VISR、OX40 和 OX-40 L。结果表明，与低 IEPS 评分组相比，高 IEPS 评分组上述所有检查点的表达都更高，表明高 IEPS 评分组处于免疫抑制状态，这可能对免疫检查点抑制剂治疗具有更好的反应。综上所述，作者对 IEGs 进行了全面分析，发现它们在 HCC 免疫抑制微环境的形成中起重要作用，其中 CAD 和 PIGU 是核心基因。基于 IEGs 构建的 IEPS 模型和列线图具有很强的临床价值，因为它们可以准确预测 HCC 患者的 OS 并评估 HCC 的 TIME。 它将帮助作者为 HCC 患者制定个性化的治疗计划并改善他们的预后。
两组之间的免疫细胞特征和免疫检查点。（A）基于 CIBERSORT 的 TCGA 队列中 CAD 、 PIGU 和免疫细胞之间的相关性。（B）基于 CIBERSORT 的 ICGC 队列中 CAD、PIGU 和免疫细胞之间的相关性。（C-F）IEPS 评分与 Tregs 和 M0 巨噬细胞浸润之间的关联。（G-N）TCGA 队列的高 IEPS 亚组和低 IEPS 亚组中几个突出免疫检查点的表达比较。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
CAD 和 PIGU 促进 TGF-β1 在 HCC 中的表达
随后，作者打算进一步研究这两个基因在 HCC 中的功能。免疫组织化学测定显示，与相邻的肿瘤肝组织相比，肿瘤样本中两个基因的表达水平都显著升高CAD 是一种多酶蛋白，可启动并调节嘧啶从头生物合成，显著影响核苷酸平衡、细胞生长和增殖 [ 31 ]。研究表明，CAD 可与 GOT1 和 UMPs 结合形成嘧啶复合物，受 AMPK 调节，在肿瘤进展中起重要作用 [ 32 ]。然而，目前仍然缺乏关于 CAD 在肿瘤免疫微环境中的作用的研究。作者之前的分析已经证明了 CAD 表达与 TME 内 Tregs 浸润增加之间存在相关性。这种关联对于在 HCC 中建立免疫抑制微环境的作用可能至关重要。先前的研究表明，在 HCC 中，肿瘤来源的 TGF-β1 促进 Treg 的分化，从而诱导 TME 内的免疫耐受 [ 33 ]。因此，作者进一步研究了 CAD 和 TGF-β 1 之间是否存在相关性。TCGA 数据库中的数据显示，CAD 在 HCC 中的表达与 TGF-β1 的表达呈显著正相关。 9 然后作者进行了细胞实验，以研究 CAD 和 TGF-β1 在 HCC 细胞系中的关系。作者使用 qRT-PCR 检测正常肝细胞系和 HCC 细胞系中 CAD 的表达。 9 结果表明，CAD 在 Huh7 和 SNU-449 中的表达在所有细胞系中最低，因此作者用 CAD 过表达质粒转染它们以分析 CAD 在 HCC 中的潜在作用。 结果表明，TGF-β1 的 mRNA 表达随着 CAD 表达的上调而增加。Western blot 结果表明，这不仅在 RNA 水平上，而且在蛋白质水平上。此外，作者在 CAD 碱性表达水平最高的 Hep3B2.1-7 和 MHCC97-H 中使用 siRNA 敲低 CAD。结果表明，TGF-β1 随着 CAD 的下调而降低。此外，作者还研究了 HCC 细胞分泌 TGF-β1 是否受 CAD 影响。ELISA 结果表明，CAD 表达增加会增强 TGF-β1 的分泌，而表达降低会减少 TGF-β1 的分泌。此外，作者发现 PIGU 在 mRNA 和蛋白质水平上促进 TGF-β1 的表达，并增加 TGF-β1 的分泌。
使用 IHC 和细胞实验验证两个 IEG 和 TGF-β 1 之间的关联。（A）使用 IHC 检测 CAD 和 PIGU 在 8 对 HCC 和肝组织中的表达水平（白色比例尺为 50 μm）。（B） CAD 在不同 HCC 细胞系中的基本表达。（C） qRT-PCR 检测 CAD 在 Huh7 和 SNU-449 细胞系中的过表达效率。（D） qRT-PCR 检测 Huh7 和 SNU-449 细胞系过表达 CAD 前后 TGF-β1 表达水平的变化。（E-G）Western blot 分析 Huh7 和 SNU-449 细胞系中 CAD 过表达前后 TGF-β1 表达水平的变化。（H） TCGA 数据库中 CAD 与 TGF-β1 的相关性。（I） qRT-PCR 检测 CAD 在 Hep 3B2.1-7 和 MHCC97-H 细胞系中的过表达效率。（J） qRT-PCR 检测 Hep 3B2.1-7 和 MHCC97-H 细胞系 CAD 敲低前后 TGF-β1 表达水平的变化。（K-M）Hep 3B2.1-7 和 MHCC97-H 细胞系 CAD 敲低前后 TGF-β1 表达水平变化的 Western blot 分析。ELISA 检测 CAD 过表达前后 Huh7 和 SNU-449 细胞系上清液中 TGF-β1 的变化。ELISA 检测 CAD 敲低前后 Hep 3B2.1-7 和 MHCC97-H 细胞系上清液中 TGF-β1 的变化。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
CAD 促进原位 HCC 模型中 Tregs 的增加
为进一步验证 CAD 的功能，将 CAD 过表达 Hepa1-6 细胞和载体对照细胞原位移植到 C57BL/6 小鼠肝脏中，进行肝内肿瘤植入实验。肿瘤生长三周后，对小鼠进行体内成像，然后解剖以取出肝脏以观察和比较肿瘤大小。10 结果显示，过表达组的肿瘤显著大于对照组。收集肝组织进行 mIHC，结果表明 CAD 促进 TGF-β1 的表达并增加 TME 中 Tregs 的浸润。 10 综合结果，作者的实验证实 CAD 和 PIGU 通过促进 TGF-β 1 的表达促进 Treg 细胞的浸润，从而导致 HCC 中的免疫抑制微环境。这可能是患者预后不良的关键因素。CAD 可能成为 HCC 的新型治疗靶点，激活患者的抗肿瘤免疫反应并增强免疫治疗的疗效。
CAD 对原位 HCC 模型生长和 Tregs 浸润的影响。（A）原位植入小鼠 HCC 模型的方案。（B-C） 小鼠的体内成像。（D-E） 收获后原位植入模型的小鼠肝脏照片。（F）肝组织的多重免疫组织化学染色（白色比例尺为 50 μm）。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
总结
作者的研究表明，HCC 的 IME 表现出显着的异质性，其中 IEGs 起着至关重要的作用。CAD 和 PIGU 在这方面发挥着关键作用。作者基于 PIGU 和 CAD 开发的 IEPS 和 列线图模型可以准确预测 HCC 患者的 OS 和 IME 状态，为肝癌患者的个性化治疗评估和随访提供新工具。从机制上讲，作者发现 CAD 和 PIGU 通过增加 TGF-β 1 的转录和翻译来促进 Tregs 在 TME 中的浸润。CAD 和 PIGU 有可能成为 HCC 的新治疗靶点。
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