导语

4+单细胞+分型+预后模型+实验验证，小众方向丝毫不卷，换个肿瘤随随便便又是一篇~~
结果：

鉴定 T 细胞标志物基因表达谱
过滤 scRNA-seq 数据集GSE149655 后，从最初的 12,554 个细胞中选择了 9533 个细胞（ 图 S1A）。使用 RunPCA 和 RunTSNE 函数进行 PCA 和 t-SNE 降维，选择了 40 个维度（ 图 S1B、C）。使用 FindNeighbors 和 FindClusters 函数（分辨率 = 0.1）进行细胞聚类，得到 14 个亚组。亚组注释基于经典的免疫细胞标志物：亚组 2 和 4 是 T 细胞（CD2、CD3D、CD3E、CD3G），亚组 12 是 B 细胞（CD79A、MS4A1），亚组 7 和 11 是肥大细胞（TPSAB1、CPA3）。亚组 0 、 5 、 8 、 9 和 13 是表达 EPCAM 的上皮细胞，1 和 10 是表达 PECAM1 的内皮细胞，亚组 6 是表达 COL1A1 、 COL1A2 和 DCN 的成纤维细胞 （ 图 S1D）。
其中Fig. 1 A 是肿瘤样本和正常样本的 t-SNE 图， Fig. 1 B 是 14 个亚组的 t-SNE 图， Fig. 1 C 是注释亚组的 t-SNE 图。通过 FindAllMarkers 函数筛选 7 个亚组的标记基因，logFC = 0.5 和 Minpct = 0.35。校正 p < 0.05 后，作者只显示每个亚组中前 5 个标记基因的表达 （ Fig. 1 D）。此外，6 个亚组的标记基因用 “clusterProfiler” 包 （ E）注释 KEGG Fig. 1 。
t-SNE 分析和标记基因表达的结果。（A） 肿瘤组织和正常组织分布的 t-SNE 图。（B） 14 个亚群分布的 t-SNE 图。（C） 细胞注释后亚群的 t-SNE 图。（D） 注释亚群的前 5 个标记基因表达的点图。（E） 注释亚群的 KEGG 富集分析的点图。
分子亚型的构建
通过单细胞分析共筛选出 124 个 T 细胞相关标记基因，并根据这些基因的表达进行一致的聚类。根据 CDF，确定最佳 Clusters 数量。通过观察 CDF Delta 面积曲线，可以看出当 cluster 选择 3 时，它有一个相对稳定的聚类结果 （Fig. 2 A， B）。最后，作者选择 k = 3 得到三种分子亚型 （ Fig. 2 C）。通过进一步分析这三种分子亚型的预后特征，可以看出它们之间存在显著的预后差异（ Fig. 2 D）。同时，通过对其他数据的验证，发现在数据集中 GSE3120 以相同的方式获得了 3 个亚型，其预后与 TCGA 数据集 （ Fig. 2 E）相似。
在 LUAD 样本中鉴定的预后分子亚型。（A） 来自 TCGA 队列的样本的 CDF 曲线。（B） 来自 TCGA 队列的样本的 CDF Delta 面积曲线。（C） 共识 k = 3 时样本聚类的热图;（D） 显示 TCGA 队列中三种亚型之间预后关系的 Kaplan-Meier 曲线。（E） 描述 GSE31210 队列中三种亚型之间预后关系的 Kaplan-Meier 曲线。
对于 TCGA 数据集，比较了不同临床特征下分子亚型的分布。卡方检验显示，cluster1 和 cluster2 在性别上存在显著差异。然而，在 T 期，cluster1 亚型在 T1 期的样本多于 cluster2 和 cluster3。在患者生存或死亡状态下，cluster1 亚型的患者大多处于生存状态（ 图 S2）。
分子亚型中与免疫和炎症相关的功能
首先，通过 ESTIMATE 算法计算患者的免疫评分。通过比较 kruskal.test，发现预后良好的 cluster1 免疫评分较高 （Fig. 3 A）。然后，通过 MCPcounter 包计算 10 种细胞的评分，发现免疫细胞的 cluster1 评分较高 （ Fig. 3 B）。然后通过 CIBERSORT 方法计算 22 个免疫细胞的评分，发现大多数免疫细胞 （ Fig. 3 C）的 3 种亚型之间存在显著差异。最后，在免疫检查点基因方面，通过 kruskal.test 比较发现 cluster1 亚型的免疫检查点基因表达较高 （ Fig. 3 D）。
免疫评分的分子亚型比较。（A） TCGA 数据集中 ESTIMATE 预测的三种亚型免疫评分的比较。（B） TCGA 数据集中通过 MCPcounter 方法预测的 10 个细胞评分的三个亚型之间的比较。（C） TCGA 数据集的 CIBERSORT 算法预测三种亚型之间 22 种免疫细胞评分的比较。（D） TCGA 数据集中三种亚型之间的免疫检查点表达比较。ns 不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
此外，本研究还通过 ssGSEA 方法计算了标记基因的相关通路评分。如图所示Fig. 4 ，通过 wilcox 检验，cluster1 亚型的炎症相关通路评分显著高于其他亚型。
三种亚型之间炎症相关途径评分的比较。p < 0.001。
用于构建风险模型的机器学习方法
在 TCGA 的 LUAD 数据集中，不同组间不同基因的比较结果如下：通过肿瘤组和非肿瘤组的比较分析，获得 1731 个与肿瘤发生相关的基因。其中，725 个基因上调，1006 个基因下调。在 cluster1 和非 cluster1 的比较中，有 197 个与 cluster1 相关的基因，195 个基因上调，2 个基因下调。在 cluster2 和非 cluster2 的比较中，有 342 个基因与 cluster2 相关，31 个基因上调，311 个基因下调。在 cluster3 与非 cluster3 的比较中，有 0 个基因与 cluster3 相关。其中， 图 S3 为上述差异分析的火山图。
在对上述各组间差异基因的结果进行交集分析后，本研究发现了 225 个关键基因 （ Fig. 5 A）。通过对 225 个基因的单变量 cox 分析，在 p < 0.01 （ Fig. 5 B）的条件下筛选出 49 个与预后相关的基因。通过这个基于机器学习的集成程序整合了 49 个基因，以开发一致的相关模型方法。在 LUAD 数据集中，通过 LOOCV 框架拟合了 101 个预测模型，并进一步计算每个模型在所有验证数据集上的 C 指数 （ Fig. 5 C）。有趣的是，最优模型是 Lasso 和 plsRcox 的组合，即平均 C 指数高达 0.652。最后筛选出 7 个关键基因 （CPA3、S100P、CD79A、CHRDL1、PGC、SLC34A2、CPS1）。数据风险评分的计算公式为：RiskScore=-0.097*CPA3+0.094*S100P-0.096*CD79A-0.121*CHRDL1-0.09*PGC-0.112*SLC34A2+0.102*CPS1。通过 TCGA 数据集和 3 个数据集验证 7 个基因的表达量，计算风险评分，风险评分为 z 评分，高低风险组除以 0。如 Fig. 5 D 所示，TCGA 建模数据和 3 个验证数据 （ GSE31210 、 GSE50081 和 GSE68465 ） 均为高危预后差异，低危预后良好 （p < 0.05）。
基于机器学习方法构建 LUAD 癌症患者预后风险模型。（A） 关键基因筛查的维恩图。（B） Cox 预后基因。（C） 机器学习筛选和构建风险模型的最佳组合。（D） 训练集和验证集中高低风险组的 Kaplan-Meier 曲线。
不同临床特征的风险评分比较
在分析了患者风险评分与肿瘤临床特征的关系后，可以理解为：在 TCGA 数据集的研究中，发现随着风险评分的增加，临床分级逐渐增加 （Fig. 6 A）。然后， Fig. 6 B 显示比较不同临床分级的风险评分，发现临床分级越高的患者风险评分越高。最后，以 Sankey 图的形式找到临床分级较高的样本，其中更多的样本被分配到高危人群 （ Fig. 6 C）。
不同临床特征的风险评分比较。（A） 在不同临床特征的比较下，风险评分逐渐升高。（B） 不同临床特征的风险评分比较（wilcox 检验）。（C） 高低风险人群不同临床特征的分布。ns 不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
结合临床表型特征比较风险模型预测患者预后的优势
本研究综合考虑了从上述结果获得的风险评分和临床特征，依次进行了单因素和多因素的 Cox 回归分析。结果显示，风险评分是最重要的预后因素 （Fig. 7 A， B）。为了量化患者的风险评估和生存概率，本文建立了一个列线图，如 Fig. 7 C 所示，结合了多变量 Cox 结果中的风险评分和其他临床病理特征 （N 分期和 T 分期）。从新构建模型的结果来看，它对生存率预测的影响最大。此外，作者使用校准曲线来评估模型的预测准确性，例如 Fig. 7 D。作者可以观察到 1 、 3 和 5 年三个校准点的预测校准曲线接近标准曲线，这表明列线图具有良好的预测性能。此外，决策曲线用于评估模型的可靠性。可以观察到，风险评分和列线图的益处显著高于极值曲线。与其他临床病理特征相比，列线图和风险评分均表现出最强的生存预测能力，如 Fig. 7 E、F。同时，作者计算了不同表型的 C 指数。通过 Fig. 7 G，作者发现风险评分和列线图的 C 指数优于其他表型。
列线图模型的构建和评价结果。（A） LUAD 患者风险评分和临床特征的单变量 Cox 分析。（B） 风险评分和临床特征的多变量 Cox 分析;（C） 列线图模型。（D） 列线图 1、3 和 5 年的校准曲线。（E） 列线图的决策曲线。（F） 与其他临床病理特征相比，列线图表现出最强大的生存预测能力。（G） 风险评分与临床特征的 C 指数比较。p < 0.001。
高低风险人群的潜在监管途径
在 KEGG 数据库的基因集上，用 “GSVA” 包计算 LUAD 患者的通路评分，用 “Hmisc” 包计算通路评分与风险评分的相关性。最后，在 |cor|>0.4 和p < 0.05 的条件下，筛选出 58 条风险评分显著丰富的通路。从 Fig. 8 A 中可以看出，低风险组的免疫相关通路得分较高，表明低风险组的免疫相关通路被激活。如 B 所示 Fig. 8 ，是 58 条通路的相关性分析热图。
高危组和低危组的潜在调控途径。（A） 高危组和低危组 58 种潜在调控通路评分的结果。（B） 58 种潜在调控通路和风险评分的相关性分析。
高危人群和低危人群的免疫特性
如Fig. 9 A 所示，LUAD 中免疫评分与风险评分的相关性是通过 spearman 统计方法计算的，结果表明风险评分与免疫评分之间存在显著的负相关。然后用相同的方法分析 ssGSEA 计算的风险评分与 28 种免疫细胞之间的相关性，结果还显示大多数免疫细胞与风险评分 （ Fig. 9 B）呈显著负相关。
分析高低风险人群的免疫特性。（A） 风险评分与免疫评分之间的相关性分析。（B） 28 种免疫细胞评分与风险评分之间的相关性分析。（C） 风险评分与 TIDE 评分的比较。（D） 免疫治疗反应组与无反应组的风险评分比较。（E） 免疫治疗反应组与无反应组的 TIDE 评分比较。p < 0.0001。
在 TIDE 预测评分中，评分越高，免疫逃逸的可能性越高，然后患者从免疫治疗中受益的可能性就越小。通过C （spearman 相关系数 R = 0.19，p % 3C 0.001） 的 Fig. 9 证明，发现随着风险评分的增加，TIDE 预测评分也增加。这也从侧面反映了风险评分较高的患者不太可能从免疫治疗中获益。同时，与预测免疫治疗反应的组相比，无反应组的 TIDE 评分和风险评分更高 （ Fig. 9 D， E）。
高、低风险人群的药物敏感性
通过药物反应数据集 CTRP 和 PRISM 为高危人群选择潜在化合物。通过评估高危组和低危组之间的药物反应差异来筛选低 AUC 的化合物。结果，五种 CTRP 衍生物 （GSK461364、KX2-391、莱托霉素 B、紫杉醇和长春新碱; 图 S4A）和 14 种 PRISM 衍生物 （Bi-2536、卡巴他赛、头孢他素、多西他赛和多拉他汀-10 等）; 图 S4B）通过风险评分与 AUC 值的 Spearman 相关性分析确定 （P 值 < 0.001 和 Spearman < -0.3 的 R）。
CPA3 在 CD4+ T 细胞亚群中的差异表达及其与活化和分化的相关性
为了研究 CPA3 在 CD4+ T 细胞中的功能，作者首先检测了 CPA3 在健康人和野生型小鼠 CD4+ T 细胞中的表达。作者从健康人的外周血 PBMC 中分离出初始 CD4+ T 细胞，然后用抗 CD3 和抗 CD28 抗体激活 TCR 信号。在激活初始 CD4+ T 细胞指定时间后，作者发现健康人初始 CD4+ T 细胞中 CPA3 的 mRNA 表达水平随着激活时间 （ Fig. 10 A）的增加而显着增加。此外，作者通过流式细胞术从 Foxp3-EGFP 小鼠中分离出分选 Treg 细胞 （CD4+CD25+ GFP+） 和效应 T 细胞 （CD4+GFP-CD44hi Tem）。与未活化的幼稚 CD4+ T 细胞 （CD4+GFP-CD25-CD44low） 相比，Treg 细胞中 CPA3 的表达水平显著低于幼稚 T 细胞，而 CPA3 在有效 T 细胞中的表达水平较高 （ Fig. 10 B）。
分析 CPA3 表达及其在 CD4+T 细胞活化、分化和肿瘤免疫中的作用。（A） 进行 qRT-PCR 检测 CPA3 在 CD4+ T 细胞中表达的内源性表达。（B） 与未刺激的幼稚 CD4+ T 细胞 （CD4+GFP-CD44hi，Tem） 相比，Foxp3-EGFP 小鼠 Treg 细胞 （CD4+CD25+GFP+） 和效应 T 细胞 （CD4+ GFP-CD44hi，Tem） 中的 CPA3 表达水平。（C-D） 幼稚 CD4+ T 细胞从健康人/野生型小鼠分化后的 CPA3 mRNA 表达。ns 不显著，**p < 0.01，***p < 0.001。
此外，作者研究了 CPA3 在不同 Th 细胞亚群中的表达分布，探讨了其与 Th 细胞活化和分化的相关性。作者成功地从健康人和野生型小鼠样本中体外生成了 Th1、Th2、Th17 和 Treg 细胞亚群。结果显示，CPA3 mRNA 表达水平在健康人和小鼠的 Th1 细胞中都相对较高 （ Fig. 10 C、D）。
CPA3 过表达通过细胞因子调节增强 Th1 分化并促进肿瘤细胞凋亡
接下来，作者研究了 CPA3 对 T 细胞分化的影响。幼稚的 T 细胞用 CPA3 过表达。结果显示，与阴性对照组 （Control） 相比，CPA3 过表达显著增加了 CD4+ IFN-γ 和 CD4+ TNF-α 细胞的比例 （ Fig. 11 A， B）。RT-PCR 分析显示，与阴性对照组相比，CPA3 过表达导致 IFN-γ 表达增加，而 IL-4、IL-17 和 IL-10 表达水平降低。这些结果表明 CPA3 过表达促进 Th1 分化 （ Fig. 11 C， D）。ELISA 结果进一步证实 CPA3 过表达增强 Th1 分化，IFN-γ 表达增加，IL-4、IL-17 和 IL-10 表达降低。同样，CD8 + IFN-γ 和 CD8 + TNF-α 细胞的百分比显著增加 （ Fig. 11 E， F）。RT-PCR 和 ELISA 分析显示 IFN-γ 、 TNF-α 和颗粒酶 B 的 mRNA 和蛋白表达分别升高 （ Fig. 11 G、 H）。
CPA3 过表达对 T 细胞分化、细胞因子谱和肿瘤细胞凋亡的影响。（一、二）CPA3 表达对 CD4+ T 细胞分化亚群影响的流式细胞术分析。（三、二）CPA3 表达对 CD4+ T 细胞细胞因子表达影响的 RT-PCR 和 ELISA 分析。（一、二）CPA3 表达对 CD8+ T 细胞分化亚群影响的流式细胞术分析。（克、高）CPA3 表达对 CD8+ T 细胞细胞因子表达影响的 RT-PCR 和 ELISA 分析。（I） 流式细胞术分析，用于评估 CPA3 过表达 T 细胞与肿瘤细胞共培养后的细胞凋亡。（J） 流式细胞术分析过表达 CPA3 T 细胞与肿瘤细胞共培养后 GranzymeB 和 IFN-γ 的水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
接下来，作者研究了 CPA3 过表达 T 细胞 （CPA3-OE） 对肿瘤细胞凋亡的影响。与肺腺癌细胞 （A549 和 PC9） 分别共培养 24 小时后，作者发现 CPA3 过表达 T 细胞比对照组 （ Fig. 11 I）显着增加肺腺癌细胞凋亡率。同时，颗粒酶 B 和 IFN-γ 表达显示，过表达 CPA3 的 T 细胞与肿瘤细胞共培养显著上调颗粒酶 B 和 IFN-γ 的表达水平 （ Fig. 11 J）。

总结

综上所述，作者通过将 scRNA-seq 数据与大量 RNA-seq 数据整合，开发了一种由 7 个 T 细胞标志基因组成的新的预后特征。此外，风险评分与 TME 、免疫相关途径和药物敏感性显著相关。作者的研究为 T 细胞标志基因在 LUAD 患者预后和精准治疗中的作用提供了新的理论见解。