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01 研究背景
辣椒素是辣椒中主要的辣味成分，它能够通过选择性地激活感觉神经元来引发一种灼烧般的疼痛感。这些感觉神经元可以将关于有害刺激的信息传递给中枢神经系统。研究人员采用了一种基于钙离子流入的表达克隆策略，从感觉神经元中分离出了一个能够编码辣椒素受体的功能性cDNA。这个辣椒素受体是一种非选择性阳离子通道，其结构与TRP家族离子通道的成员相似。此外，这种克隆的辣椒素受体还能被可引起疼痛的温度所激活，这表明它在体内可能作为疼痛性热刺激的感受器发挥作用。
02 研究结果
由于缺乏关于辣椒素受体分子结构的具体信息，研究人员需要采用一种策略来寻找可能编码辣椒素受体的cDNA。他们决定采用功能性筛选策略，即通过观察细胞对辣椒素的反应来筛选可能的cDNA克隆。辣椒素能够在体外触发感觉神经元中强烈的钙离子流入。研究人员推测，如果一个cDNA克隆能够编码辣椒素受体，那么这个cDNA克隆可能使非神经元细胞在暴露于辣椒素时也表现出类似的钙离子增加。研究人员利用背根神经节（dorsal root ganglion）的信使RNA构建了一个cDNA文库。将cDNA文库细分为大约16,000个克隆池，然后将每个池暂时转染到人胚胎肾细胞系（HEK293）中，接着转染后的细胞被加载荧光钙敏染料Fura-2，然后在显微镜下检查辣椒素引起的细胞内钙水平变化。通过迭代细分和重新检测，最终获得了一个含有3-kb cDNA插入片段的单个克隆，这个克隆单独就能使转染的HEK293细胞对辣椒素或树脂毒素（resiniferatoxin）敏感。由于辣椒素和树脂毒素的结构中都含有香草醛（vanilloid）基团，这些化合物的作用位点通常被称为香草醛受体。因此，研究人员将新克隆的cDNA命名为VR1，即香草醛受体亚型1。
Fig1. 利用钙成像技术检测表达辣椒素受体的克隆
在非洲爪蟾卵母细胞中表达VR1，并用全细胞电压钳分析法定量研究香草醛受体激动剂和拮抗剂对电生理反应的影响。在静息电位时，辣椒素或树脂毒素刺激会引起表达VR1的卵母细胞产生剂量依赖性内向电流反应，而在注水对照细胞中则不会。同时辣椒素诱发的反应在VR1表达细胞中被香草醛受体拮抗剂辣椒碱可逆地阻断。VR1另一个药理学特性是对非竞争性拮抗剂钌红的敏感性，而钌红能以一种可逆的方式阻断辣椒素引起的内向电流反应。此外，从几个辣椒品种中获得乙醇提取物，并在卵母细胞表达系统中测定其与辣椒素饱和剂量(10 uM)相关的效价，实验结果发现这些辣椒的不同“辣度”（主观感受），与它们激活VR1受体的能力（客观指标）是一致的。
Fig2. 纯化的香草类和胡椒类提取物激活VR1
进一步，研究人员对转染VR1的哺乳动物细胞进行了一系列的膜片钳研究。在全细胞膜片钳中，VR1转染的HEK293细胞表现出强烈的内向电流（在-60 mV的钳制电压下），辣椒素浴液作用下表现出极短的潜伏期。在无VR1转染的细胞中未观察到该电流。在无钙培养基中，无论是在恒定的 -60 mV保持电位下，还是在-100mV到+40mV电压阶段内(增量为20mV)，辣椒素诱发电流不随时间变化而变化。 由于反转电位接近0 mV，辣椒素介导的反应必然涉及到阳离子选择性通道的开启。因此研究者们进行了一系列的离子置换实验，以检测不同阳离子对辣椒素诱发电流在 VR1表达细胞中的相对贡献。不同阳离子成分的溶液中的细胞所建立的电流-电压关系表明 VR1不区分单价阳离子，但对二价阳离子表现出明显的偏好。渗透顺序: Ca2+ >Mg2+ >Na+≈K+≈Cs+）。【反转电位：在电生理学中，反转电位是指在细胞膜电位达到某一特定值时，离子的净流动为零，此时的膜电位记为该离子的反转电位】
在培养的感觉神经元中，香草醛诱发电位会随着香草醛持续暴露而脱敏。这种电生理脱敏可能部分依赖胞外钙离子。实际上，在没有细胞外钙的情况下，VR1转染的细胞中辣椒素诱发的电位很少出现脱敏现象。相反，在含钙培养基中，辣椒素在第3次刺激时诱发的电位相比于第1次刺激时减少了4.3%。而对VR1转染的细胞给予辣椒素刺激后，观察到了幅度较大且清晰可分辨的单通道电流，这提示这些细胞膜中存在辣椒素激活的离子通道。在单通道水平上，电流-电压关系与在全细胞膜片钳下建立的几乎相同，这是由于其具有外向整流特性以及在相似的离子条件下反转电位接近 0mV。有研究表明，香草素的作用位点可能并不局限于质膜的胞外侧。作者发现，将辣椒素加入到表达VR1的细胞的膜两侧时，能够产生相同的反应，由此推测香草醛受体在质膜两侧具有功能等价的辣椒素结合位点。
Fig3 VR1是一种非选择性阳离子钙通道
VR1基因含有2514个核苷酸，编码838个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为95000。亲水性分析表明 VR1含有6个跨膜结构域，在跨膜结构域5和6之间还有一个短的疏水性伸展。氨基末端亲水段(432个氨基酸)含有一个相对富含脯氨酸的区域，其后是三个锚蛋白重复结构域。羧基端(154氨基酸)没有可识别的序列。通过蛋白质数据库的同源性检索，研究人员发现 VR1与钙通道家族成员(SOCs)之间存在显著的相似性，后者是果蝇视网膜蛋白TRP和TRPL的典型成员。这个家族的成员介导细胞外钙离子流入细胞，以应对细胞内钙的消耗。这些蛋白质的拓扑结构与VR1相似，具有多个N端氨基酸重复的脯氨酸富集区，其次是三个氨基酸重复结构域。
Fig4. VR1蛋白结构
辣椒素作用的高度选择性表明辣椒素受体可以作为痛觉神经元的特异性分子标记。Northern免疫印迹实验结果显示VR1在三叉神经节和背根神经节中显著表达,而在其他受检组织中都不存在。采用免疫组织化学检测VR1表达的细胞模式，结果表明，在背根神经节和三叉神经节中，VR1主要表达在小直径的神经元亚群中。这与观察到大多数辣椒素敏感神经元具有相对较小到中等大小的胞体是一致的。
Fig5. VR1特异性表达在感觉神经元
香草醛诱导的疼痛是一种类似于热的“燃烧”的感觉，这一点可能表明香草醛和热可能通过共同的分子途径引起疼痛反应。为了探讨高温对 VR1活性的影响，研究人员将转染的 HEK293细胞的周围环境温度突然从22°C上升到45°C，并进行荧光钙成像。此条件下，单独转染载体的细胞只表现出细胞质游离钙的轻微弥散变化。相反，大部分表达VR1的细胞在二次热处理后钙含量明显增加，这些实验结果表明VR1具有热敏感性和温度反应特性。当细胞暴露于快速升高的温度时，表达VR1的细胞产生了较大的内向电流。在细胞恢复至静息电位时，再用500 nM的辣椒素刺激细胞，发现辣椒素引起的内向电流幅度与之前温度引起的内向电流幅度相似。这进一步支持了VR1既能被温度激活，也能被辣椒素激活。为了确定VR1是否能在不同的细胞环境中对热产生类似的反应，研究人员将实验进一步扩展到卵母细胞系。当细胞外环境温度急剧升高时，对照组细胞会产生一个小的内向电流，仅温度升高至50℃电流呈线性增加；表达VR1的卵母细胞在40℃及以下表现出与对照组相似的反应，但当温度超过40℃时，卵母细胞能够产生更大的电流变化，这提示VR1可能在高温中感知中发挥重要作用。综上，这些结果表明VR1可被伤害性热刺激激活。
Fig6. 伤害性热刺激激活VR1
当组织因感染、炎症或缺血导致pH降低时可能会引起组织疼痛。因此，质子可能作为VR1内源性激活剂或者调节剂。为验证这一假说，研究人员检测了氢离子对辣椒素受体的影响。在没有辣椒素的情况下，研究人员将溶液pH突然从7.6降到5.5，结果显示表达VR的卵母细胞中只有不到10%表现出较大的内向电流，这表明氢离子单独不能有效地激活这种蛋白质。接着研究人员评估了降低pH值对于VR1对辣椒素反应的影响。表达VR1的卵母细胞在pH = 7.6时接受次高浓度辣椒素刺激(300 nM)。研究发现，一旦细胞的电流反应达到一个相对稳定的平台期后，将这些卵母细胞暴露在相同辣椒素浓度但pH=6.3的环境中，卵母细胞的内向电流迅速增加到一个新的平台，其幅度比第一个平台高出5倍。当溶液pH恢复到7.6时，卵母细胞的反应减弱到最初的平台，去除辣椒素后又回到基线。这些结果表明，虽然单独的氢离子不足以激活VR1，但可以显著增强辣椒素诱发的反应，这可能是通过增加辣椒素的效力来实现的。
Fig7. 质子是VR1内源性调节剂
03 结论
明确了辣椒素作用于感觉神经元上的一个离子通道蛋白—VR1
阐明了辣椒素介导疼痛刺激的产生是转导了化学刺激和热刺激这两种刺激，即VR1受体不仅能被香草醛化合物激活，还能被伤害性热刺激激活
TRPV1疼痛领域的发现，为疼痛靶点的研究开拓了全新的领域。
原文作者介绍 Author
David Julius, PhD
Professor of UCSF
人类的感官系统如何感知世界