微精选

为了识别参与机械转导的蛋白，研究人员首先从小鼠和大鼠多种细胞系中（Neuro2A、C2C12、NIH/3T3、Min-6、50B11、F11和PC12）筛选出类似原代细胞MA的细胞系，用来代替原代细胞进行相关研究。接着，研究人员使用一种压电驱动玻璃探针对细胞表面施加压力，同时利用另一根玻璃管进行全细胞膜片钳记录。在这些细胞系中，Neuro2A细胞在适应持续刺激时的速度比其他细胞系（比如C2C12细胞系）更快，且更稳定。N2A和C2C12的MA电流在-80到+80mV之间呈线性关系，其反转电位分别为+6.6mV和+6.7mV，而内向电流可以被NMDG所抑制。作者进一步对N2A的细胞外膜的MA电流进行记录。负压脉冲可以引发内源性通道的开放，其单通道电导为22.9±1.4pS，反转电位为6.2mV。增加压力脉冲的幅度可以诱导更大且可逆的电流。电流-压力关系在-60mmHg时通道开放最大，最大半激活压力（P50）为-28±1.8mmHg。这些电导和P50的特性与已经报道的拉伸激活通道相似。

为了在N2A细胞中筛选候选的MA离子通道蛋白，研究人员使用了Affymetrix微阵列来寻找N2A细胞中富集的转录本，并用siRNA对每个候选蛋白进行测试。Fam38A基因敲低导致MA电流显著下降，这说明Fam38A编码的蛋白可能与MA离子通道的形成密切相关。使用针对此基因的siRNA亦能显著降低MA电流，进一步证明了Fam38A编码的蛋白与MA离子通道的关联。鉴于Fam38A编码一种对压力激活的离子通道表达所需要的蛋白，研究人员将这个基因命名为Piezo1。随后研究人员测试了Piezo1是否是N2A细胞压力刺激诱发的MA电流所必须的，使用Piezo1的siRNA处理细胞，发现MA电流减少，证实了Piezo1在N2A细胞产生MA电流过程中起关键作用。

在许多动物、植物以及其他真核生物物种中仅含一个Piezo蛋白。脊椎动物中有两个成员Piezo1（Fam38A）和Piezo2（Fam38B）。但早期脊索动物海鞘只有一个Piezo成员。在纤毛虫门中存在多个Piezo蛋白，这可能与它们独特的细胞结构和生理功能有关。酵母和细菌中没有发现明确的Piezo同源物，表明Piezo蛋白可能是真核生物特有的。Piezo蛋白的二级结构在不同物种中是中等保守的。研究人员通过跨膜隐马尔可夫模型预测程序分析，所有的Piezo蛋白都预测到24-36个跨膜结构域。预测的蛋白包含2100-4700个氨基酸，跨膜结构域的分布在推测蛋白全长中。膀胱、结肠、肾脏、肺和皮肤中均有Piezo1的表达，这种表达模式与大鼠的Northern blot表达分析结果一致。膀胱、结肠和肺会经历与内脏痛相关的机械转导，而肾脏中的初级纤毛感知尿流。但DRGs中Piezo1的mRNA表达较低，这可能是DRGs中观察不到MA电流的原因。然而，Piezo1在另一个体感部位-皮肤上表达。Piezo2也在膀胱、结肠和肺中表达，但在肾脏和皮肤中较少；而在DRGs上观察到Piezo2的强表达。这可能意味着Piezo2在感觉神经元中对机械刺激的感知和信号转导起着关键作用。

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Piezo1在多种细胞类型表达MA电流

研究人员从N2A细胞中克隆了完整的Piezo1基因，并将其插入到pIRES2-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）载体中。在转染后的12h-48h，在GFP+细胞中记录到了MA电流的激活。不管在N2A细胞、HEK293T细胞还是C2C12细胞系中，只要转染了Piezo1基因的细胞都表现出MA电流特征，说明Piezo1基因的表达能够引起细胞产生较大的MA电流。此外，研究人员采用了摸拉伸的方法，通过细胞外记录模式的膜片钳技术检测了转染Piezo1基因的细胞。结果显示，在N2A细胞和HEK293T细胞中过表达Piezo1基因后，施加-60mmHg的压力脉冲时，会产生较大的电流。过表达Piezo1的细胞和内源性N2A细胞的电流-压力曲线相似，但仅转载了空载体的HEK293T细胞中未检测到与N2A细胞内源性MA相似的电流。

研究人员从DRG中克隆出全长的Piezo2基因，并将Piezo2基因和GFP基因共同转染到N2A细胞和HEK293T细胞中，转染后这些细胞表现出巨大的MA电流。除此之外，N2A细胞还被共转染了Piezo1的siRNA抑制内源性的MA电流。在表达Piezo2的细胞中MA电流与电压在-80至+80mV间呈线性关系，其中N2A细胞的反转电位为+6.3±0.4mV，HEK293T细胞的反转电位为+8.3±1.5mV。那么Piezo1和Piezo2介导的MA电流特征是否有差异呢？通过进一步对比了Piezo1和Piezo的失活电流，发现Piezo2诱导的MA电流无论在内向电流还是外向电流其失活速度更快。

为确定Piezo2在DRGs中的表达情况，研究人员在成年小鼠DRGs切片进行原位杂交：观察到20%的DRG神经元存在Piezo2 mRNA的表达，表达Piezo2的神经元中有60%同时表达周围蛋白，28%同时表达神经丝蛋白200，说明Piezo2主要存在于机械感觉神经元的亚群中；而且Piezo2和TRPV1的表达有24%的重叠，进一步暗示了Piezo2可能参与了伤害性机械刺激过程。研究人员使用Piezo2 siRNA研究其在DRG的MA电流中的作用，并用记录了全细胞MA电流。根据电流的失活（T_inac）特征进行分组：T_inac＜10ms，10＜T_inac＜30ms，T_inac＞30ms和无反应组。在转染了Piezo2 siRNA的神经元中，在T_inac＜10ms时MA电流激活幅度显著减少，表明Piezo2基因对于神经元快速失活的MA电流至关重要。