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EGFR 突变 NSCLC 细胞中 TET2 诱导的吉非替尼耐药性抑制为确认 TET2 抑制在 EGFR TKI 抗药性中的作用，研究了 TET2 KD 对细胞增殖和凋亡的影响。通过 RNAi 和慢病毒载体转染技术生成了 TET2-KD PC9 细胞（PC9TET2 KD）和 H1650 细胞（H1650TET2 KD）的稳定细胞系，并通过西方印迹法评估了敲低效率（见图 1A， B）。TET2 的抑制会诱导 EGFR 突变 NSCLC 细胞对吉非替尼的耐药性。（A， B）。采用西方印迹法测定了 PC9 和 H1650 细胞系中 TET2（TET2-KD）的敲低效率。（C，D）。 使用 Annexin V/PI 检测法监测不同组在接受吉非替尼（1 微米）治疗后 72 小时的细胞凋亡情况。（E，F）。 TET2-KD 和对照细胞细胞凋亡的定量化（*p < 0.05）。（G， H）。采用西方印迹法测定了 PC9 和 H1650 细胞系中 TET2（TET2 OE）的过表达效率（**p < 0.01，***p < 0.001）。（I，J）。 使用 CCK-8 检测法监测不同剂量吉非替尼处理的细胞组增殖情况（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，CONT KD 与 TET2 KD;#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001，以及 TET2 KD 与 TET2 KD + TET2）。（K）。采用西方印迹法检测不同组别中磷酸-EGFR 和磷酸-ERK。采用 2 样本 t 检验评估显著性。使用 Annexin V/PI 检测法在用吉非替尼（1 微 M）治疗 72 小时后，不同组的细胞凋亡情况。细胞凋亡分析中，1 μM 吉非替尼治疗显著增加 PC9 和 H1650 细胞的凋亡率;然而，TET2 KD 显著减弱了吉非替尼诱导的细胞凋亡（见图。1C-F）。通过��病毒载体转染产生了 TET2 过表达的 PC9 细胞（PC9TET2 OE）和 H1650 细胞（H1650TET2 OE）的稳定细胞系，并通过西方吸迹法评估了其过表达效率（见图 1G， H）。采用 CCK-8 检测法评估不同剂量吉非替尼（0–10.0 微米）治疗组的细胞增殖情况。PC9 和 H1650 细胞中 TET2 的 KD 显著降低了吉非替尼诱导的细胞增殖抑制。相反，TET2-KD PC9 细胞（PC9TET2 KD+TET2）和 H1650 细胞（H1650TET2 KD+TET2）中提取 TET2 时，对吉非替尼的反应增强（见图 1I-J）。这些数据表明，TET2 在调控 EGFR 突变 NSCLC 细胞对第一代 EGFR TKIs 的敏感性方面起着关键作用。在分析磷酸-EGFR 及下游 ERK 磷酸化时，作者观察到 TET2-KD 细胞中磷酸-EGFR 和磷酸-ERK 的含量相较对照细胞有所增加。在 PC9TET2 KD 细胞中，10 μM 吉非替尼实现了 EGFR 的完全失活，而在 PC9CONT KD 细胞中，0.1 μM 的吉非替尼足以完全去磷酸化受体。相反，TET2-KD PC9 细胞中 TET2 的救援（PC9TET2 KD+TET2）降低了 phospho-EGFR 和磷-ERK 水平（图 1 K）。因此，这些体外研究结果证实了作者的假设，表明 TET2 的抑制在第一代 EGFR TKI 耐药中起作用。TET2-KD PC9 细胞中 DNA 甲基化的变化TET2 在维持 DNA 脱甲基化及多种人类癌症中 TET2 表达下降的关键作用表明，TET2 在调节 DNA 甲基化以维持正常细胞功能方面具有非冗余作用（16,21），暗示 TET2 抑制可能通过增加相关基因的 DNA 甲基化诱导 EGFR TKI 耐药性。为验证这一观点，作者通过 RRBS 比较了 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞系的全局 DNA 甲基化谱。PC9CONT KD 细胞系之一的代表性质量检测数据见。基本信息，包括原始测序读段、读段长度、所有碱基数量、处理后干净读序列数及比较信息。在所有用于测序的八个细胞系（四个 PC9TET2 KD 细胞系和四个 PC9CONT KD 细胞系）中，成功生成了 890 万至 2200 万个独特的可用读段（质量经过过滤并比对到人类基因组），用于 DNA 甲基化分析。展示了 PC9TET2 KD 细胞系和 PC9CONT KD 细胞系 DNA 甲基化的代表性数据。质量检查后，使用 R 甲基套件分析了不同甲基化状态和功能标注，包括不同 CpG 的覆盖、不同甲基化 CpG 的分布、不同特征区域的 CpG 分布，以及不同样品和差别甲基化区域（DMRs）间 CpG 甲基化的差异。对 CpG 不同特征区的注释显示，基因组中 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞中的 CpG 分布相似（见图 2A）。每条染色体中覆盖率最低且差异显著的部位中，高甲基化和低甲基化事件的百分比如图 2B 所示（高 DMR 定义为甲基化变化≥5%，p 值< 0.05;PC9TET2 KD 与 PC9CONT KD）。展示了 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞差异的 CpG 位点完整列表;展示了 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞之间 DMR 的完整列表。R 甲基套件用于分析微分甲基化状态和功能注释。（A）。对 CpG 不同特征区的注释显示，CpG 在基因组中的分布在 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞中相似。（B）。横条图显示了每条染色体中覆盖率最低且差异性最小位点的超甲基化和低甲基化事件数。高或低 DMR 定义为甲基化变化≥5%，p 值为 3C 为 0.05 的病组;PC9TET2 KD vs. PC9CONT KD。通过生物信息学分析，在 TET2-KD PC9 细胞中鉴定出十个候选高甲基化基因为选择差异甲基化基因，采用了中等严格的差异甲基化 CpGs，且其差异至少为 5%，p 值为 0.05，从而在假发现率和假阴性率之间取得可接受的平衡22,23。当某区域位于编码基因的启动子区时，不同基因组的表达水平可能会受到甲基化的影响，导致表达差异。最终，作者鉴定出 710 个具有潜在生物学意义的 DMR，这些 DMR 位于 695 个不同基因的启动子区域。功能聚类分析是一种能够在多种常用注释类型或不同注释词层级内对相似注释进行聚类的算法，用于研究基因本体（GO）术语富集和信号通路（KEGG 信号富集与注释），是探索数据库中与研究重要相关的功能基因类别的最常用方法。由于本研究聚焦于 TET2 抑制在 EGFR TKI 耐药性中的作用和机制，传统的富集分析方法可能会遗漏许多位于关键耐药通路中的基因，因此注释方法被调整用于分析 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 之间药物耐药通路中差异化的甲基化基因细胞。注释使用了 MSigDB（分子特征数据库）提供的基因集下载文件。C2 中列出的所有典型通路均用于通路注释。每个差分基因的 GO 术语和信号通路注释。随后，筛查了 83 个药物耐药途径中差异甲基化基因（启动子），以便进一步分析。如上所述，TET2 表达的降低可能通过增加相关基因的 DNA 甲基化来诱导 EGFR TKI 耐药性。PC9TET2 KD 细胞中有 43 个基因具有高甲基化启动子区域。基于本研究背景，为探究 EGFR TKI 耐药机制，作者回顾了每个基因的功能及相关文献。最后，作者选择了 10 个与肿瘤生长、增殖、侵袭或耐药相关的候选基因进行进一步验证：AXIN2、PIDD1、NR4A1、CSK、SHC1、GHR、SOX17、POU4F2、SPI1 和 WNT4。PC9 细胞中代表性基因及其在吉非替尼耐药性中作用的验证启动子处 DNA 甲基化异常对基因表达产生严重影响，并且与转录抑制密切相关。作者假设，与 PC9CONT KD 细胞相比 ，与高甲基化相关的表达变化很可能代表抑制事件。随后，作者通过 RT-PCR 检测了 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞中十个候选基因的表达，结果与 RRBS 数据一致。PC9TET2 KD 细胞中十个基因的表达低于 PC9CONT KD 细胞，唯独 POU4F2 除外。其中 AXIN2 和 CSK 在两组间表达显著差异。（图 3）AXIN2 和 CSK 在 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞间表达显著差异。（A）。PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞之间 AXIN2 的 mRNA 水平比较。（B）。比较 PC9TET2 KD 和 PC9CONT KD 细胞间 CSK 的 mRNA 水平。采用 2 样本 t 检验评估显著性。基于这些发现，作者假设 TET2 KD 通过诱导 AXIN2/CSK 甲基化并下调 AXIN2/CSK 表达，促进对 EGFR TKIs 的耐药性。为了确定 AXIN2/CSK 抑制是否诱导对 EGFR TKIs 的抗药性，利用 RNAi 技术生成 AXIN2-KD PC9 细胞（PC9 AXIN2 KD）和 CSK-KD PC9 细胞（PC9 CSK KD）。采用西方墨迹法验证蛋白质敲低效率（图 4A、B）。重要的是，CSK 耗竭未改变 AXIN2 表达，排除了代偿机制。作者发现 PC9 细胞中 AXIN2-KD 显著降低了吉非替尼诱导的细胞增殖抑制（图 4C，D）。在细胞凋亡分析中，吉非替尼治疗显著增加了 PC9 细胞的凋亡，且 AXIN2 的丧失导致吉非替尼治疗后凋亡细胞比例增加（见图 4E）。考虑到 PC9AXIN2 KD 细胞本身的细胞凋亡率本身较高（PC9AXIN2 KD 细胞的基线凋亡率为 21.73%），PC9 细胞的相对凋亡率（即将吉非替尼处理的细胞凋亡率除以 DMSO 处理的同类型细胞的凋亡率）在 AXIN2 表达被抑制时被吉非替尼处理降低（见图 4F ）。通过慢病毒载体转染产生稳定的 PC9 细胞系，并通过西方印迹法评估了其过表达效率（见图 4G）。 为进一步确认 AXIN2 在抗 EGFR TKIs 中的作用及 AXIN2 与 TET2 之间的关系，采用西方印迹法检测 PC9CONT KD、PC9AXIN2 KD、PC9TET2 KD 和 PC9TET2 KD+AXIN2 OE 细胞系中的 AXIN2 蛋白表达。结果显示，PC9AXIN2 KD 和 PC9TET2 KD 细胞中的 AXIN2 表达显著低于 PC9CONT KD 细胞。与 PC9TET2 KD 细胞相比，PC9TET2 KD+AXIN2 OE 细胞中的 AXIN2 表达显著更高（见图 4H）。采用 CCK-8 检测法评估不同剂量吉非替尼（0.001–10.0 μM）治疗组的细胞增殖情况。PC9 细胞中 TET2 的 KD 显著降低了吉非替尼诱导的细胞增殖抑制效果。相反，TET2-KD PC9 细胞（PC9TET2 KD+AXIN2 OE）中 AXIN2 的过度表达会增加对吉非替尼的反应（见图 4I）。使用 Annexin V/PI 检测法在用吉非替尼（1 微 M）治疗 72 小时后，不同组的细胞凋亡情况。与 PC9CONT KD 组相比，PC9TET2 KD 组的凋亡率和凋亡比率显著较低。与 PC9TET2 KD 组相比，PC9TET2 KD+AXIN2 OE 细胞系的凋亡率和比例显著更高（见图 4J，K）。这些发现表明，TET2 的抑制通过 DNA 甲基化依赖的 AXIN2 下调，促进 EGFR 突变 NSCLC 中吉非替尼耐药性。TET2 抑制可能通过 DNA 甲基化依赖的 AXIN2 下调，促进 EGFR 突变 NSCLC 的吉非替尼耐药性。（A，B）。 采用西方印迹法测定 PC9 细胞系中 AXIN2/CSK 的敲低效率。为 AXIN2 和 CSK 蛋白的不同位点设计了三种不同的 sgRNA，导致了不同的移码突变效率和 KD 效率。最后，选定了敲低效率最高的细胞系进行后续研究。（C，D）。CCK-8 检测法用于监测不同剂量吉非替尼治疗的细胞群增殖情况（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。（E）。使用 Annexin V/PI 检测法监测不同组在接受吉非替尼（1 微 M）治疗后 72 小时的细胞凋亡情况。（F）。AXIN2-KD 与对照 PC9 细胞 （G） 的相对凋亡速率。采用西方印迹法测定 PC9 细胞系中 AXIN2（AXIN2 OE）的过表达效率。（H）。采用西方印迹法检测 PC9CONT KD、PC9AXIN2 KD、PC9TET2 KD 和 PC9TET2 KD+AXIN2 OE 细胞系中的 AXIN2 蛋白表达。（一）。用不同浓度的吉非替尼（0.001–10 微米）处理的 PC9CONT KD、PC9TET2 KD 和 PC9 TET2 KD+AXIN2 OE 细胞在 48 小时内的增殖率（*p < 0.05，***p < 0.001）。（J）。用 1 微米吉非替尼处理的 PC9CONT KD、PC9TET2 KD 和 PC9AXIN2 KD 细胞凋亡率，持续 72 小时。 PC9TET2 KD、PC9TET2 KD+AXIN2 OE 及对照 PC9 细胞的相对凋亡速率（*p < 0.05）。采用 2 样本 t 检验评估显著性。地西他滨（DCA）逆转了 TET2-KD EGFR 突变 NSCLC 细胞中的吉非替尼耐药性如果 TET2 抑制通过 AXIN2 高甲基化促进对 EGFR TKIs 的耐药性，则应通过使用 DNA 甲基转移酶抑制剂 DCA 治疗逆转该耐药。随后，作者对 PC9TET2 有 DCA 和无 DCA 治疗的 KD 细胞进行了 BSAS 检测。结果显示，接受 DCA 处理的 PC9TET2 KD 细胞中 AXIN2 的甲基化水平显著低于未处理的 PC9TET2 KD 细胞（见图）。5 具体来说，CpG 站点 28、51、75、80、82、99、103、112、161、194 和 231 在两组之间显示出统计学上显著的差异（图 5 B）。随后，作者进行了体外增殖检测，以测试 DCA 是否能逆转 PC9TET2 KD 细胞中的吉非替尼耐药性。结合吉非替尼抑制 DNA 甲基转移酶，细胞增殖显著减少，CCK-8 检测结果显示（图 5C）。与对照组相比，72 小时的吉非替尼治疗后，TET2 的丧失导致凋亡率下降，DCA 治疗则显著逆转（图 5D，E）。得西他滨逆转 TET2-KD EGFR 突变 NSCLC 细胞中的吉非替尼耐药性。对 PC9TET2 KD 和 PC9TET2 KD + DCA 处理细胞的 BSAS 分析（A）PC9TET2 KD 和 PC9TET2 KD + DCA 细胞系 AXIN2 的甲基化平均值。（B）PC9TET2 KD 和 PC9TET2 KD + DCA 细胞系中 AXIN2 基因中 CpG 位点的 DNA 甲基化水平（X 轴：CpG 位点;纵轴：DNA 甲基化水平;每条线代表一组样本，*p < 0.05）。（C） CCK-8 检测法用于监测不同剂量吉非替尼（0.0001-1 μM）±DCA（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，以及 TET2 KD 与 TET2 KD + DCA）（D） 处理的不同细胞组的增殖情况。使用 Annexin V/PI 检测法监测了在吉非替尼±DCA 治疗后不同组的细胞凋亡程度。（E）。相对凋亡速率见图 5B（*p < 0.05，***p < 0.001）。（F）。在吉非替尼±DCA 治疗后，使用西方印迹法检测不同组的 AXIN2 和磷酸 ERK。（G）。通过 DNA 羟甲基化（5-hmC）ELISA 试剂盒检测到 5-hmC 在不同 PC9 细胞群中的表达（*p < 0.05）。采用 2 样本 t 检验评估显著性。此外，DCA 与吉非替尼联合使用时，TET2-KD 细胞中的磷酸 ERK 水平下降。此外，PC9TET2 KD 细胞中的 AXIN2 表达相比用吉非替尼处理的 PC9CONT KD 细胞下调。与未进行 DCA 处理的 PC9TET2 KD 细胞相比，AXIN2 表达在得西他滨处理的 PC9TET2 KD 细胞中上调（见图 5F ）。TET2 催化 5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），5-hmC 则导致胞嘧啶的去甲基化。作者的结果显示，TET2 的缺失抑制了 PC9 细胞中 5-hmC 的表达，而 DCA 处理则显著增加 5-hmC 的表达（图 5 G）。这些结果表明，抑制 DNA 甲基转移酶可以逆转 EGFR 突变 NSCLC 细胞中由 TET2 抑制引起的吉非替尼耐药性。得西他滨增强了 PC9TET2 KD 细胞体内对吉非替尼的敏感性研究 PC9CONT KD 和 PC9TET2 KD 肿瘤携带小鼠对吉非替尼及吉非替尼加 DCA 联合使用的反应，当肿瘤平均体积达到 400mm 时 ，口服 20 mg/kg 吉非替尼或 PBS，口服 5 天，首周腹腔内给药 1.0 mg/kg 的 DCA，连续 5 天。 随后每周注射 3 次（见图 6A）。TET2 缺乏导致对吉非替尼的耐药性增加。然而，吉非替尼+DCA 处理的 PC9 TET2 KD 小鼠肿瘤体积（见图 6B、C）和肿瘤重量 （图 6B、D）显著低于单用吉非替尼治疗的 PC9 TET2 KD 小鼠。这些结果表明，抑制 DNA 甲基转移酶可以在体内逆转由 TET2 抑制诱导的吉非替尼耐药性。体重监测显示治疗组间无显著差异（p > 0.05），证实吉非替尼-DCA 组合无全身性毒性。得西他滨能增强 PC9TET2KD 细胞对吉非替尼的敏感度。（A）。动物实验时间线。（B）。各组肿瘤的照片。（C）。从治疗开始（第 21 天）到终点（第 32 天）在不同治疗组中每三天监测肿瘤大小（**p < 0.01，TET2 KD + 吉非替尼 vs. TET2 KD + 吉非替尼 + DCA）。（D）。不同治疗组监测肿瘤体重。 总结 综上，作者揭示了 TET2 抑制诱导 AXIN2 甲基化是 EGFR 突变 NSCLC 中 EGFR TKIs 的一种新抗性机制。去甲基化药物有潜力克服由功能丧失型 TET2 突变引起的 EGFR TKI 耐药性。这些结果不仅拓展了作者对 NSCLC 患者药物耐药性分子机制的理解，也为第一代 EGFR TKI 耐药性 NSCLC 患者的潜在治疗策略提出了建议 。
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