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为了确定纳林素对肝细胞癌（HCC）和正常肝细胞的抑制作用，作者评估了纳林素对一个正常细胞系（WRL）和两个肿瘤细胞系（HUH7，MHCC-97 H）的细胞毒性效应。对于正常细胞系，低浓度（80 微米、160 微米）和短期处理（24 小时）对细胞存活率影响不大。胅林素在癌细胞系（HUH7，MHCC-97 H）中对剂量和时间的抑制表现出明显依赖。此外，比较显示，纳林素的不良反应在癌细胞中比正常细胞更为明显（见图。2a-c）。为评估纳林素对三条细胞系的影响，作者构建了时间依赖和剂量依赖的曲线。24 小时时的 IC50 值通过分析剂量-反应可行性曲线确定。MHCC-97 H 和 HUH7 的 IC50 值分别为 182.2 微米和 165.7 微米。根据图 2d 和 e 所示结果，180 微米钠林素浓度诱导了后续测序实验中对 MHCC-97 H 细胞系的 24 小时处理。纳林根素对细胞增殖的影响。（A）MHCC-97 H HUH7 WRL 在连续浓度的芫宁治疗后，细胞存活时间为 24 小时，（B）48 小时， 以及（C）72 小时。（C-D）24 小时时的剂量依赖性活动曲线。信息以三倍实验所得值的平均±标准差形式呈现。在比较控制组时，观察到显著水平分别为 0.05、0.01 和 0.001。肿瘤细胞迁移过程在肝细胞癌的发展和进展中至关重要。为了研究纳林根素对细胞迁移和入侵的影响，作者采用了刮痕测试和 transwell 实验。作者的研究显示，不同浓度的纳林根素显著抑制细胞迁移和入侵（见图。3.a-h）。 在 MHCC-97 H 细胞中，80μM 和 160μM 的迁移抑制率分别为 47.4%和 57.9%。同样，在 HUH7 细胞中，80μM 和 160μM 纳林根素的迁移抑制率分别为 43.6%和 55%。透孔检测结果与上述结果一致，MHCC-97 H 细胞中 80μM 和 160μM 纳林根素的迁移抑制率分别为 28%和 44.5%，HUH7 细胞中为 40%和 52%。体外纳林根素已被发现会阻碍细胞迁移和入侵。通过视觉示意，分析伤口愈合测定（A-D） 和 Transwell 测定 （E-H） 的结果，评估细胞迁移情况。三次方实验值的平均±标准差表达了所有数据。与对照组相比，p 值为 0.001。Hoechst 33,258 是一种细胞膜渗透的荧光染料，可以渗透到活细胞中。与双螺旋 DNA 相互作用时，会发出特征性的蓝色荧光。在凋亡过程中，染色为 Hoechst 33,258 的细胞核表现出增强的荧光，同时出现形态学变化，这些变化表明细胞凋亡，包括染色质缩合和核碎裂。作者的发现显示，随着纳林根素浓度的增加，凋亡率的剂量依赖性增强（见图。4a）。具体来说，暴露于 160 微米纳林根素 24 小时后，MHCC-97 H 和 HUH7 细胞系的凋亡率分别为 10%和 8%，较未处理对照组显著提升。在 320 微米浓度下，MHCC-97 H 细胞的松林腺素浓度增加至 30%，HUH7 细胞为 27%（见图 4b-c）。本研究数据显示，随着纳林根素浓度的增加，细胞凋亡的持续上升趋势。通过 Hoechst 33,258 染色观察到凋亡。（A） 随着药物剂量的增加，凋亡细胞数量逐渐增加。不同剂量处理的细胞表现出显著的形态变化，如染色质缩合和细胞核解体，这些都表明细胞凋亡的迹象。（B，C）97 个 H 细胞和 HUH7 细胞凋亡的统计结果。误差条代表标准差。与对照组相比，*** p < 0.001。为了更精确地确定细胞凋亡并区分凋亡细胞与坏死细胞，采用了流式细胞术。分析显示，随着凋亡早期和晚期细胞数量的增加，存活细胞群体数量呈剂量依赖性下降（见图。5A-B）。机械性病死的发生率未超过 4%。在定量总凋亡分数后，发现在接受 160 μM 纳林根素 24 小时处理后，约 8.9%的 MHCC-97 H 队列发生了凋亡，这一数字与对照组的 3.25%形成显著对比。与此同时，HUH7 细胞表现出 6.48%的凋亡率，同样与对照组的 3.7%显著不同。暴露于 320 μM 纳林根素的细胞，凋亡率分别约为 24.7%和 22.28%。通过流式细胞术和形态学检查所得结果的比较分析显示，在相同条件下，160 μM 纳林根素处理的细胞 24 小时内的凋亡速率是一致的。使用纳林根素处理后，MHCC-97 H 和 HUH7 细胞发生凋亡。（A） 采用流式细胞术技术检测和评估 MHCC-97 H 和 HUH7 细胞的各阶段凋亡。坏死细胞、晚凋亡细胞、早期凋亡细胞和健康细胞分别位于 Q1、Q2、Q3 和 Q4 象限。（B） 利用凋亡阶段检测结果评估了健康细胞与凋亡细胞之间的比率。结果以平均值±标准差显示，每个样本分别测量三次。标准差用误差条表示。显著差异为*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，#p < 0.0001（或****p < 0.0001）。在寻找肝细胞癌中纳林根素潜在新靶点的过程中，作者最初进行了转录组测序，鉴定出了 4390 个差异表达的基因。随后，作者对 TCGA 的 LIHC 数据集进行了差异分析，发现了 4498 个差异表达的基因（见图）。6a-b）。随后，作者采用了中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、SwissTarget 和 DrugBank 数据库的筛选技术，识别出 131 个与纳林根素相关的靶基因。最后，利用维恩图 21，作者确定了交集基因作为进一步研究的关键目标（图 6c）。差异表达基因和目标基因的选择。（A） 测序结果的火山图。（B）TCGA 火山剧情。（C）TCGA 差异表达基因、差异表达基因测序以及萘红素药物靶文图。为阐明基因差异表达及其对生物代谢过程影响的调控机制，作者对注释基因进行了功能富集分析。这种方法使作者能够提取更深层的功能洞见。分析最终生成了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）22 富集图（图 7a-b），分别突出了前 30 个富集词和通路。在 GO 类别中，最重要的 10 个术语包括对脂肪酸的反应、DNA 结合转录因子活性的正向调控、细胞对脂肪酸的响应、有机阴离子转运、羧酸转运、有机酸转运、Wnt 信号通路、细胞间通过 Wnt 的信号传导、区域化以及上皮管形态发生。领先的 10 条 KEGG 通路包括 Wnt 信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、肌醇磷酸代谢、MAPK 信号通路、鞘脂代谢、氨基酸和核苷酸糖代谢、肝细胞癌、神经营养素信号通路、人类瘤病毒感染和轴突引导。功能富集分析揭示了潜在的治疗靶点，阐明了纳林根素可能调节肝细胞癌细胞的途径。值得注意的是，Wnt 和 MAPK 信号通路成为纳林根素治疗效果中最显著的通路（图 7c-d）。相关基因（A， B） 的富集分析：4390 个交叉目标差异表达基因的前 30 个显著富集 GO 和 KEGG 通路项（P < 0.05）。作系统环境中纳林根宁的综合路径图。（C） WNT 信号通路 14（D） MAPK 信令通路 14。为了验证关键靶点在肝细胞癌中的作用，基于 TCGA 数据库中的数据，作者比较了正常肝组织与肝细胞癌中关键靶点的表达水平。如图 8a 所示，肝细胞癌组织中的 AKR1C3、PGF、CA9 和 KLK1 表达水平显著高于正常肝组织。测序结果显示，CA9、KLK1 和 AKR1C3 的表达水平显著降低，进一步表明这些基因是纳林根素的关键靶点。为评估临床预后与关键目标基因之间的关系，作者利用仙涛构建了 Kaplan-Meier 生存曲线以进行生存分析。结果显示，关键靶点表达较高的患者总体生存期（OS）显著低于关键靶点表达较低的患者（p < 0.01），表明这些关键靶点与患者存活率之间存在密切相关性（图 8 b）。此外，为预测 1 年、2 年和 3 年生存率，作者绘制了所有关键目标的时间依赖生存 ROC 曲线，发现所有 AUC 值均大于 0.5（图 8c）。这些发现表明，已识别的关键目标具有有效的预后价值。钠感蛋白关键靶点的表达水平和诊断价值。（A） 正常骨和肝组织中中心靶点的表达水平与 HCC 组织的比较。（B） 关键目标基因表达高（红色）和低（蓝色）表达（P < 0.05）的 HCC 患者 OS（总体生存期）生存曲线。（C） ROC（受试者作特征）曲线，确认关键靶标表达在诊断和预后预测中的准确性（AUC = 1.000）。基于 TCGA 队列评估 HCC 概率的命名图。（A） 用于预测 1 年、3 年和 5 年总体生存率（OS）概率的线值图。（B，C） 时间依赖 AUC 曲线。（D–F） 预测（D）1 年、（E）3 年和 （F）5 年时 OS 概率的校准曲线。首先进行了单变量 Cox 回归分析，以确定六个主要靶点作为肝细胞癌整体生存（OS）预测变量的潜在独立性（见表 1）。研究发现 IGFBP3、PGF、CA9、AKR1C3 和 OS 之间存在显著关联。随后，作者对单变量 Cox 回归研究中 p 值大于 0.05 的重要目标进行了多变量 Cox 回归分析。其中，CA9 和 AKR1C3 被鉴定为 HCC 的独立预后因子。结年图有助于通过整合多种预后和决定因素来生成临床事件的个体概率。在作者的研究中，作者基于年龄、性别、肿瘤分期、病理分期、CA9 和 AKR1C3 构建了计量图。结果如图 9 所示，显示该计录图在预测 5 年内 OS 时，AUC 值与时间相关，持续超过 0.6。此外，该命名图在预测 1、3 和 5 年存活率方面与观察值保持相对较佳的一致性。总之，基于 CA9 和 AKR1C3 的命名图能够有效预测 HCC 的短期和长期闭塞率。该预测模型为临床诊断、治疗和管理提供了宝贵支持。利用 qRT-PCR 验证了 6 个关键目标基因的基因表达水平（见图）。结果显示 qRT-PCR 和 RNA-seq 数据中观察到的表达趋势总体一致，表明这些关键目标基因在信号转导通路中的转录调控中具有高度可靠性。然而，值得注意的是，一个基因（CA9）的表达趋势与 RNA-seq 结果相比存在不一致趋势。这种差异可能归因于 RNA-seq 作为大规模筛查整体基因表达趋势工具的固有性质，无法保证每个基因的 qRT-PCR 结果完全一致。qRT-PCR 技术被用于评估关于内部参考基因的特定重要靶点的定量表达。qRT-PCR 数据以平均±标准差报告，样本量为n=3。统计分析显示以下水平有显著差异：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。为验证关键目标基因蛋白表达水平与 RNA-seq 结果的一致性，进行了 Western blot（WB）实验。结果表明，WB 验证的关键目标基因的蛋白质表达趋势与 RNA-seq 数据大致一致，如图所示。11. 这一观察到的一致性进一步支持了这些关键目标基因在信号转导通路中的关键作用，为深入了解其功能和调控机制提供了关键见解。这些发现为研究该信号通路的调控机制和潜在治疗靶点提供了宝贵线索。通过西方墨迹法检测到的中心靶蛋白表达的代表性图像（A）。 三个独立实验 （B） 的数据作为三重实验的平均值±标准差（SD）。*p < 0.05;**p < 0.01;与对照组相比，p3C 为 0.001。为了进一步研究纳林根素与关键靶点之间的相互作用，作者使用了 CB-Dock2 在线分析工具进行分子对接。根据相关文献，化合物与蛋白质之间的结合能低于−5 kcal/mol 被认为是稳定结合的标志。结果显示，纳林根素与所有蛋白的结合能均低于−5 kcal/mol，表明纳林根素与关键靶点之间具有强烈的结合亲和力。有趣的是，AKR1C3 和 CA9 的结合效果最佳，结合能分别为−9.5 kcal/mol 和−8.5 kcal/mol，这与临床预后分析结果一致。这些发现进一步支持了纳林甘宁与关键靶点，特别是 AKR1C3 和 CA9 具有强烈结合亲和力的观点。异培啶与这些目标基因的结合亲和力及结合细节见图。12. 黄苯二醇与目标氨基酸残基之间的关键相互作用参数总结于表 2。纳林根宁和关键靶点的分子对接结果。（a） 胙烯-AKR1C3（PDBID：1s1p）。（B） 胙林素-CA9（PDB-ID：3iai）。（C） 胯味素-IGFBP3（PDB-ID：7wqr）。（D） 纳林宁-PGF（PDB-ID：1fzv）。（E） Naringenin-KLK1（PDB-ID：1spj） （F） Naringenin-CHRNA7（PDB-ID：3sq6）。为评估纳林根素的体内抗癌活性，利用 MHCC-97 H 细胞系构建了一个稳健的皮下异种肿瘤模型（见图）。13a）。接种后十天肿瘤可见。从第 15 天到第 35 天，胅烯每天腹腔注射一次。在此期间，治疗组与未治疗组体重无差异。观察到未治疗组肿瘤体积显著增加（图 13b）。第 36 天，小鼠被处死，肿瘤被切除以进行形态学和组织学检查。治疗组的肿瘤重量和体积均较未治疗组减少。HE 影像显示，治疗组的坏死组织数量低于未处理组。此外，它们表现出正常特征。治疗组和未治疗组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏均正常（图 13c-e）。萘焦素在体内抑制肿瘤生长。体内实验工作流程示意图（A）。 裸体小鼠与肿瘤成像 （B）。 肿瘤大小 （C）。 肿瘤重量 （D）。 代表性 H&E 正在染色肿瘤、肝脏、肾脏和脾脏的图像。比例杆 = 100 微米。数据以 ST±均值形式呈现。对照组的 p 值分别为*P < 0.05、**P < 0.01 和***P 0.001。 总结 综合研究结果表明，纳林根素在体外有效抑制肝细胞癌细胞的增殖，并显著抑制肝细胞癌肿瘤在体内的生长。本研究利用 mRNA 测序、实验验证和分子结合等多种科学方法，证实了纳林根素作为治疗肝细胞癌的有效多靶点药物的潜力。值得注意的是，无论是体外还是体内实验均未观察到不良反应，证实了纳林根素作为膳食植物天然成分的固有安全性。本研究为纳林根素在肝细胞癌治疗中的药理机制提供了坚实的科学依据，并为未来临床转化研究奠定了基础。
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