循环肿瘤 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)检测, 即所谓的“液体活检”。ctDNA指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，其中包含了来源于肿瘤的突变和基因变异信息。ctDNA是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，且适用于多种肿瘤，为肿瘤的非侵入性取样提供了机会。血液中的 ctDNA 很少, 只占整个循环 DNA 的 1%，甚至只有 0.01%，且进入血流的 ctDNA 易受肿瘤部位、大小、转移灶、血管浸润、肿瘤状态分期等的影响, 导致其测量差异较大。
一、液体活检常见术语
1. 循环肿瘤细胞（CTCs，circulating tumour cells）
2.循环肿瘤DNA（Cell-free tumor DNA）
3.细胞外囊泡（EVs，extracellular vesicles）
4.循环游离RNA（cfRNA，circulating cell- free RNA）
5.循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）
常见的液体活检分析物
二、ctDNA来源
1、来自于坏死的肿瘤细胞；
2、来自于凋亡的肿瘤细胞；
3、来自于肿瘤细胞分泌的外排体。
三、ctDNA长度
ctDNA并不是一整条或者随机的进入血液的，它们有自己的载体——核小体。核小体以单个、双联或者三联的形式进入血液，并逐步分解——有研究显示ctDNA的半衰期只有2个小时。缠绕在每个组蛋白上面的DNA约166bp（150~200 bp），大部分的ctDNA长度都在166bp左右。
四、ctDNA检测技术
cfDNA的检测可分为定量和定性两大类。由于巨噬细胞的清除作用，健康人群cfDNA含量维持较低水平。而肿瘤患者由于肿瘤细胞坏死、播散所释放的DNA超过了巨噬细胞的清除能力，因此cfDNA水平增高。游离DNA定性检测主要包括肿瘤特异性DNA的突变、重排以及甲基化。这些方法来检测DNA突变以确定ctDNA的存在，针对不同类型的肿瘤会用到不同的ctDNA检测方法，主要有以下几种：
1.Droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR、
2.Beads, emulsion, amplification and magnetics，BEAMing、
3.Tagged-amplicon deep sequencing，TAm-Seq、
4. Cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq、
5. Barcode sequencing technology、BCT
6.Whole genome sequencing，WGS
7.Whole exome sequencing，WES
8.Whole genome bisulfite sequencing, WGBS-Seq
常见的ctDNA 检测技术的对比
ctDNA 检测技术的对比
五、ctDNA优势
1.与蛋白类标记物相比，ctDNA 检测很少出现假阳性，因为 ctDNA 来自肿瘤细胞基因组突变。
2. ctDNA 半衰期短，能准确反映肿瘤当前情况。剑桥大学和约翰霍普金斯大学合作团队研究表明，检测乳腺癌和肠癌时，ctDNA 比蛋白质指标更灵敏，可跟踪肿瘤的消失、扩散和复发。
3. ctDNA 比循环肿瘤细胞更灵敏，更适合成为癌症的生物学指标。
六、ctDNA临床应用前景
1.《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。ctDNA作为液体活检的首选已逐渐从科研走向临床。
而欧盟批准将ctDNA检测用于易瑞沙的伴随诊断则更是标志着ctDNA临床应用的大规模实现。
2. 2007 年，美国约翰霍普金斯大学 Bert Vogelstein对 18 名肠癌患者的 ctDNA 进行了跟踪。研究显示，术后仍检测到 ctDNA 的患者，基本上都出现了复发，而术后未检测到 ctDNA 的患者，肠癌无复发。表明ctDNA 能展现患者对手术的应答情况。随后，研究者在其他癌症中得到了类似结果，包括卵巢癌、乳腺癌以及其他器官肿瘤，比如胰脏、膀胱、皮肤、胃、食道、肝脏和头颈。（脑癌除外，因为血脑屏障使肿瘤 DNA 无法进入血液。）
3. 2012 年，Diaz 团队研究表明，ctDNA 检测技术能更早监测到肿瘤进展。Rosenfeld 团队则利用 ctDNA 揭示了癌症抗性的发展路径。及时发现癌症抗性，能尽早停用不起作用且昂贵的药；发现潜在抗性的突变，有助于寻找有效的癌症疗法或者药物组合。
4. 2015年5月，约翰·霍普金斯大学的研究团队首次在肺癌前期病变患者血液中检测发现循环DNA，能够有望应用于早期风险预测。同时，对肺癌前期病变组织进行活检，也发现了循环DNA，该病变组织也称为非典型腺瘤性增生（AAH），且游离DNA能够侵入周围组织，导致肺腺癌的癌变。
5. 2015年11月，剑桥大学通过Pyclone方法检测一例转移性乳腺癌患者血液中ctDNA来实时追踪肿瘤进展。作者历时1193天，从一名肿瘤已经扩散到身体其它部位的42岁女性乳腺癌患者身上，采集了肿瘤样本（8个肿瘤位点）和血液样本，进行外显子和靶位点扩增测序（Pyclone）。如果在同一时间点上，活组织切片结果和进入血液中ctDNA片段结果相比较相一致，即说明肿瘤发展和相应治疗时出现了相同的模式和遗传变化时机，说明循环DNA可以实时追踪肿瘤进展。
Use of circulating tumor DNA detection in various cancer typ
七、ctDNA面临问题
目前 ctDNA 还无法成为临床上的主要诊疗手段。
1.最灵敏的 ctDNA 检测（例如 BEAMing）需事先知道想要检测的突变基因：通过活检、测序和分子探针等流程。虽然外显子组测序无需预先知道肿瘤信息，但成本高。
2.目前尚无标准的cfDNA提取方法，利用血浆还是血清，样本采集中使用不同的抗凝剂，冷冻保存的时间差异等均会影响cfDNA的浓度。
3.活检技术通常不能很好的检测早期癌症。
研究显示，ctDNA 能检测出所有 II 级以上肺癌，但只检测出了一半 I级肿瘤，因为晚期癌症释放更多的 DNA，这将限制 ctDNA 的癌症筛查作用。
4. ctDNA 是否来自未知肿瘤或转移癌？
5.目前最大的问题是：准确的肿瘤信息能否挽救患者生命或提高生活质量？
总之，ctDNA 检测是一项新技术，其在肿瘤治疗中的应用还需要深入探索。
参考文献:
1.周国锋，刘霄宇，陈颐，王小林. 循环游离DNA在胰腺癌中的临床应用进展[J]. 复旦学报(医学版), 2018, 45(01): 113-118.
2.Heitzer E. et al．Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.Nat Rev Genet (2018).
3.Li, H., Jing, C., Wu, J., Ni, J., Sha, H., Xu, X. ... Feng, J. (2019). Circulating tumor DNA detection: A potential tool for colorectal cancer management (Review). Oncology Letters, 17, 1409-1416.