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有有力证据表明，获得类似 CSC 的表型对于自我更新、肿瘤发生、转移和药物耐药性至关重要。 本研究采用功能增益和丧失研究，探讨 DCLK1 在 PCa 细胞 CSC 特性维持中的作用。作者在之前的研究中已证实，一系列 PCa 细胞系（LNCaP、PC3、DU145 和 22Rv1）中 DCLK1 mRNA 和蛋白质表达显著差异，其中 PC3 表达水平最高，22Rv111 表达最低。 因此，通过慢病毒转导工程制造了 22 个 DCLK1 过表达的 Rv1 细胞和沉默 DCLK1 的 PC3 细胞（见图 1A）。首先，作者进行了体外测定，结果显示与相应载体对照细胞相比，DCLK1 过表达的 22Rv1 细胞形成的菌落数量更多且更大的菌落，而 DCLK1 敲低的 PC3 细胞形成的菌落数量明显较少且较小（见图 1B）。这些发现表明，DCLK1 可能在 PCa 细胞的自我更新中发挥关键作用。此外，肿瘤球形成分析是评估干细胞自我更新能力的成熟方法。本研究中，球状形成实验显示，上调 DCLK1 会增加，但下调 DCLK1 会减少由 22Rv1 和 PC3 细胞形成的肿瘤球体的大小和数量（见图 1C）。此外，通过 qRT 和 PCR 在已建立的 PCa 细胞系中表达了一系列与干性相关的标记和调控因子，包括 c-Myc、OCT4、CD44、NANOG、SOX2 和 KLF4。 结果显示，DCLK1 过表达细胞中这些因子的 mRNA 表达水平显著更高，而 DCLK1 基因降落细胞的表达水平显著低于对照细胞（见图 1D-E）。综合来看，这些结果表明 DCLK1 促进了 PCa 细胞中干细胞样的表型。DCLK1 促进了 PCa 细胞的干细胞样表型。（A）西墨迹分析确认了转导后 22Rv1 和 PC3 细胞中 DCLK1 表达水平。（B）代表性图像（左面板）和比较定量（右面板）由指定细胞系形成的菌落。（C）代表性光显微照片（左侧面板）和对所指细胞系球形成能力的比较定量（右侧面板）。（D 和 E）通过 qRTPCR 确定的已建立 PCa 细胞系中，干相关标记和调控因子的 mRNA 表达水平相对水平。数据以三个独立实验的平均值±标准差呈现，P 值由双尾学生 t 检验确定;**P < 0.001， ***P < 0.001.生物信息学分析显示 DCLK1 与河马通路呈正相关研究显示，DCLK1 表达在多种人类癌症中上调，包括乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌 5、6、8。不断积累的证据支持 DCLK1 对肿瘤发生、转移及癌症干性状维持至关重要的观点，这与作者之前关于 PCa 9、10 的研究一致。此外，有力的数据支持河马通路在调节 PCa 起始、发育及干细胞特性方面的关键作用（13-16）。有趣的是，一项近期分子研究显示，抑制 DCLK1 可通过 Hippo-YAP1 信号通路下调人类胰腺癌中的 PD-L1 表达 21。因此，作者提出了一个有趣的可能性，即 DCLK1 可能与 PCa 中的河马通路相关。为探讨这一可能性，作者评估了 TCGA 数据集中 Hippo 信号通路组成部分 mRNA 表达谱的变化。作者发现 DCLK1 的表达水平（转录本/百万，TPM）与 PCa 中 YAP1 表达水平呈显著正相关（P < 0.001，R = 0.51）（见图 2A）。此外，作者还利用 GEPIA2 数据库探讨了 DCLK1 与多个信号通路的关键目标基因之间的相关性，这些通路已被测试是否 DCLK1 参与其他癌症中干细胞样性状。结果表明，DCLK1 与所有这些关键目标基因呈正相关，且与 Hippo 通路的相关系数 R（YAP1，R = 0.51）高于与 NOTCH 通路（Hes1，R = 0.37;Hes3，R = 0。25;Hes5，R = 0.22），WNT 通路（CCND1，R = 0.16;c-Myc，R = 0.27;CTGF，R = 0.24），以及刺猬通路（GLI1，R = 0.33;GLI2，R = 0.41;GLI3， R = 0.35）。此外，对 498 个 TCGA PCa 样本的数据分析显示，DCLK1 的 mRNA 表达水平与 Hippo 信号通路组分（包括 CTGF、AREG、BIRC5、AMOTL1 和 TEAD1）之间存在强烈的正相关性（见图 2B）。 因此，这些结果表明 DCLK1 与 PCa 中的河马信号通路密切相关。生物信息学分析显示 DCLK1 与河马通路之间存在相关性。（ 答 ）通过 GEPIA2 服务器探讨了 DCLK1 表达与 YAP1 表达之间的相关性。散点图显示，PCa 细胞中 DCLK1 与 YAP1 的表达水平呈显著正相关（两者均归一化至 GAPDH）。TPM，每百万的成绩单数。（B）评估了 TCGA 中 498 个 PCa 样本的 mRNA 表达谱。热图显示，DCLK1 的 mRNA 表达水平与代表性的 Hippo 信号通路基因之间存在强烈相关性。红色文字表示高等级基因，绿色矩形表示肿瘤样本中基因表达减少。DCLK1 表达的第 25 和第 75 百分位被用于将样本分类为低表达组（n=125）和高表达组（n=125）。DCLK1 抑制 Hippo 通路，通过 LATS1 激活 YAP为了进一步阐明 DCLK1 与 PCa 中 Hippo 通路之间的相关性，作者随后进行了一系列体外实验 。Western blot 分析显示，DCLK1 过表达降低了 22Rv1 细胞中磷酸化 LATS1 和 YAP1 的水平，并增加了 YAP1 的核丰度，而 DCLK1 降级则对 PC3 细胞产生相反效应（见图 3A-B）。此外，免疫荧光染色显示，DCLK1 过表达促进了 22Rv1 细胞中 YAP1 的核内易位，而在 PC3 细胞中 DCLK1 表达受抑制后，核 YAP1 染色减少（见图 3C）。YAP 是一种转录共激活因子，可以从细胞质穿梭到细胞核，主要通过与另一种具有 PDZ 结合基序的转录共激活因子（TAZ）结合 TEA 结构域（TEAD）成员来发挥作用。因此 ，进行了 HOP/HIP-flash 荧光素酶检测，以进一步探讨 DCLK1 对 YAP/TAZ-TEAD 转录活性的影响。如预期，DCLK1 过表达的 22Rv1 细胞中 HOP/HIP 活性比显著升高，而 DCLK1 下调的 PC3 细胞则降低（见图 3d）。因此，经典 YAP/TAZ 下游目标基因的相对 mRNA 表达在 DCLK1 上调细胞中显著增加，但在 DCLK1 敲低后则受损（见图 3E）。通常，当 Hippo 激酶模块处于“活性”状态时，LATS1/2 会磷酸化，从而抑制 YAP 及其旁系同源物 TAZ。为进一步验证 LATS1/2 是否参与 DCLK1 介导的 HOP/HIP 报告细胞活性调控，作者在已建立的 PCa 细胞系中敲低了 LATS1。 值得注意的是，通过敲低 LATS1，消除了沉默介导的 YAP/TAZ-TEAD 报告细胞活性抑制，而在 DCLK1 过度表达细胞中也观察到同样的消除作用（见图 3F）。这些结果证实 DCLK1 抑制 Hippo 信号通路，从而通过 LATS1 激活 PCa 细胞中的 YAP。DCLK1 抑制 Hippo 通路，导致 YAP 激活。（A 和 B）对指定细胞中所指蛋白表达进行西方印迹分析。α-管蛋白被用作总提取物的负载控制，P84 则用于核提取物的负载控制。（C）在 DCLK1 表达改变的指示细胞中评估了 YAP1 的表达和亚细胞定位，并通过荧光和激光共聚焦显微镜观察（左侧面板）。比例杆：20 微米。指的细胞核中 DCLK1 表达改变的细胞核 YAP1 比例（右图）。（d）在所指细胞中测量了 HOP/HIP 荧光素酶报告活性，指示 YAP/TAZ-TED 转录活性。（E）通过 qRT 和 PCR 分析，比较载体细胞（V）或 DCLK1-Ri（Ri#1 和 Ri#2）细胞与 Ri 载体（Ri-V）细胞与 Ri 载体细胞（Ri-V）的比较，确定了指示基因 mRNA 表达水平的 Log2 转化折叠变化。（F）YAP/TAZ-TEAD 报告活性因指示细胞中 LATS1 下调而被消除。数据以三个独立实验的平均值±标准差呈现，P 值由双尾学生 t 检验确定;P < 0.001。DCLK1 通过 YAP 信号促进 PCa 中的干性状虽然作者确认 DLCK1 抑制 PCa 细胞中的 Hippo 信号通路，但该效应是否与癌症干性状相关尚不清楚。为探讨 DCLK1 是否通过影响 Hippo 信号通路促进 PCa 的干性状，作者用 YAP 抑制剂椎泡芬处理了 DCLK1 过度表达的 22Rv1 细胞。作为小分子抑制剂，verteporfin 可以阻止 YAP/TAZ 与 TEAD 转录因子之间的相互作用，但对 DCLK1 的表达水平影响较弱（见图 4A）。 体外实验结果显示，Verteporfin 处理显著减少了 DCLK1 过度表达的 22Rv1 细胞的菌落大小和数量，肿瘤球形成测定中也观察到类似的消除效应（见图 4B-C）。此外，使用 verteporfin 处理后，干相关标志物和调控因子的 mRNA 表达水平显著下降（见图 4D）。综合来看，这些结果表明 DCLK1 依赖于 YAP 信号来调节 PCa 细胞的干性特性。DCLK1 通过 YAP 信号调控前列腺癌细胞的干性状。（A）西方斑点分析确认了所指细胞中的 DCLK1 表达水平。（B）代表性图像（左面板）和比较定量（右面板）由指定细胞系形成的菌落。（C）代表性光显微照片（左侧面板）和对所指细胞系球形成能力的比较定量（右侧面板）。（D）通过 qRT-PCR 分析的干相关标记和调控因子在指示细胞中的相对 mRNA 表达。Ver， verteporfin（10 微米，3 小时）。数据以三个独立实验±平均值显示，P 值由双尾 Student 的 t 检验确定;**P < 0.001， ***P < 0.001.DCLK1 促进体内 PCa 细胞的肿瘤发生性和干细胞样特征考虑到 DCLK1 在 PCa 肿瘤发生和进展中的参与，以及其通过 Hippo 信号传递促进 PCa 细胞干细胞样特性的潜在作用，作者进一步探讨了这些观察结果是否可以在体内复制。如图 5A-C 所示，由 DCLK1 过度表达的 22Rv1 细胞形成的肿瘤明显大于载体对照肿瘤。关于 verteporfin 在肿瘤细胞增殖中的作用，Nguyen 等人。22 发现，Verteporfin 处理对预先建立的正位 PC3 异种移植的生长没有统计学上显著的影响。同样，Fu 等人进行的动物实验中，使用脊菌素治疗并未减少皮下 SB1 肿瘤的肿瘤大小和肿瘤重量终点测量 。23. 本研究与体外实验结果一致，椎苯平治疗后观察到 DCLK1 过度表达的 22Rv1 异种移植肿瘤体积和重量显著减少。此外，作者通过免疫组化（IHC）染色，测量了上述小鼠肿瘤组织中 DCLK1 及与干相关标志物 CD44 和 NANOG 的表达（见图 5D）。DCLK1 过度表达的 22Rv1 异种移植肿瘤中，DCLK1、CD44 和 NANOG 的表达水平显著高于载体对照异种移植肿瘤。此外，使用 verteporfin 似乎未影响 DCLK1 表达，但显著降低了 CD44 和 NANOG 的表达。 因此，这些结果证实了 DCLK1 在 PCa 肿瘤发生及通过体内 Hippo 信号传导维持 PCa 细胞干细胞样性状中的关键作用。DCLK1 促进体内的 PCa 肿瘤发生性。（A）注射所指细胞系的裸鼠肿瘤图像。（B）实验期间所指异种移植肿瘤（n=5 只小鼠/组）的生长曲线。（C）实验期结束时的异种肿瘤权重。（D）代表性图像（左面板）及对比定量（右面板）针对指定组的 DCLK1、CD44 和 NANOG。Ver，verteporfin（每两天一次，腹腔注射，剂量 100 毫克/公斤体重）。数据以三个独立实验的平均值±标准差呈现，P 值由双尾学生 t 检验确定;P < 0.001。Hippo-YAP 通路的核心组成部分包括一个核转录模块和一个细胞质激酶模块。激酶级联反应的主要功能是抑制含有 YAP1 的致癌转录级联反应。在典型通路中，细胞质 YAP1 在上游磷酸化和活化 LATS1 和 LATS2 的反应中被磷酸化，导致 YAP1 的细胞质保留或随后泛素化介导的蛋白酶体降解。或者，当 LATS1/2 因 DCLK1 上调而失活时，细胞质 YAP1 的核内易位增加，且通过 YAP1 与 TEADs 和 TAZ 的相互作用，促进与 CSC 性状相关的目标基因表达，如自我更新、增殖和肿瘤生长。综合来看，作者的结果支持这样一个观点：DCLK1 的过度表达通过诱导 LATS1 介导的 YAP 信号激活，促进干细胞样表型，最终导致 PCa 肿瘤生长和进展（见图 6）。信号通路模型。DCLK1 的过度表达通过诱导 LATS1 介导的 YAP 信号激活，促进干细胞样表型，最终导致 PCa 肿瘤的生长和进展。 总结 综上所述数据支持了这样一种推测：DCLK1 的过度表达通过诱导 LATS1 介导的 YAP 信号激活，从而促进干细胞样特征，最终导致 PCa 肿瘤生长和进展。更重要的是，作者的发现为阐明 PCa 进展的潜在机制提供了新见解，并表明 DCLK1 可能是 PCa 的治疗靶点。
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