研究亮点
1.发现一种新型翻译后修饰驱动自身免疫
研究发现半胱氨酸羧乙基化是强直性脊柱炎(AS)患者PBMC中显著增加的蛋白质修饰。这种修饰由代谢物3-羟基丙酸(3-HPA)诱导，并由胱硫醚β合酶(CBS)催化，产生ITGA2B蛋白在Cys96位点的羧乙基化修饰(ITGA2B-ceC96)，生成可被免疫系统识别的新抗原。
2.揭示新抗原诱导HLA限制性自身免疫反应的分子机制
ITGA2B-ceC96肽通过HLA-DR4限制性机制被抗原呈递细胞(如树突状细胞)呈递，特异性激活CD4+ T细胞并诱导自身抗体产生，从而驱动AS的自身免疫反应。荧光偏振和ELISA实验验证了该修饰肽与HLA-DRA01/HLA-DRB104分子的特异性结合。
3.建立系统性筛选新抗原的新研究方法
研究开发了一套完整的工作流程，包括开放搜索方法通过质谱识别非编码氨基酸衍生物，结合免疫学实验验证免疫原性，为系统性筛查自身免疫疾病中关键新抗原提供了方法学框架。
4.提供疾病干预的潜在新靶点
研究表明3-HPA(主要来源于肠道微生物和食物)是驱动修饰的关键底物，抑制其上游转运蛋白(MCT1)可减轻自身免疫应答，提示通过干预代谢物水平可能成为治疗AS的新策略。
引言
强直性脊柱炎（AS）等自身免疫病可由破坏免疫耐受的新型抗原引发，翻译后修饰（PTMs）是新型抗原产生的关键机制，但AS中新型抗原形成及致病性自身反应应答的分子机制尚不明确，亟需系统性方法分析AS患者潜在PTMs并鉴定相关致病新型抗原。
文献解读
文章标题：半氨酸羧乙醇化产生新抗原以诱导HLA限制的自身免疫
发表期刊：Science
发表时间：2023年3月17日
影响因子：IF45.8/Q1
研究背景
由于强直性脊柱炎（AS）与某些主要组织相容性复合体（MHC）等位基因（包括HLA-B27）存在明确关联，该疾病被推测为自身免疫性疾病。新抗原假说认为，这些抗原可能引发异常免疫反应，导致AS患者出现致病性自身反应性T细胞应答及自身抗体生成。本研究采用系统性开放检索方法，筛选蛋白质中与基因组编码序列存在差异的氨基酸残基及其衍生物。基于此，我们从 PTM 自身抗原的潜在库中鉴定出与AS相关的具有翻译后修饰（PTMs）的新抗原，从而阐明该疾病的发病机制。
研究方法
通过质谱法筛选强直性脊柱炎（AS）患者外周血单个核细胞的翻译后修饰，鉴定半胱氨酸羧乙基化；体外验证3-羟基丙酸（3-HPA）和胱硫醚β合酶（CBS）的作用；借助流式细胞术、酶联免疫吸附试验等分析该修饰引发的免疫反应；利用HLA-DR4转基因小鼠验证其致炎和骨侵蚀作用。
研究结果
1.强直性脊柱炎（AS）患者中半胱氨酸羧乙基化水平升高
图1质谱分析显示，AS患者PBMC存在643种独特质量位移簇，72.021 Da簇显著升高且过半位于半胱氨酸残基；整合素αIIb（ITGA2B）半胱氨酸修饰增幅最显著，其Cys96位点羧乙基化在患者中特异性升高，该修饰会破坏ITGA2B二硫键结构。
图1.半胱氨酸+72.021修饰在强直性脊柱炎（AS）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中显著富集
2.3- HPA诱导ITGA2B的半胱氨酸羧乙基化
72.021 Da修饰为半胱氨酸羧乙基化，以3-HPA为底物形成稳定硫醚键；抗ITGA2B-ceC96抗体对修饰肽亲和力高且特异性识别该修饰蛋白；免疫沉淀结合LC-MS/MS证实AS患者PBMC中存在内源性该修饰，体外3-HPA可剂量依赖性诱导ITGA2B羧乙基化（图2）。
图2.半胱氨酸羧乙基化反应需要3- HPA 作为底物
CBS可依赖3-HPA、PLP及AdoMet催化ITGA2B的Cys96位点羧乙基化；293T细胞过表达CBS能以剂量和时间依赖方式提升ITGA2B-ceC96水平；体外实验进一步证实重组CBS可直接催化ITGA2B对应肽段与全长蛋白发生该修饰，明确其催化作用（图3）。
图3.半胱氨酸羧乙基化由CBS催化
3.半胱氨酸羧乙基化诱导ITGA2B的溶酶体降解并产生新抗原，从而触发CD4+ T细胞应答
ITGA2B-ceC96在体外及环己酰亚胺处理细胞中易降解，不稳定性源于Cys87-Cys96二硫键破坏；其经溶酶体途径降解，巴佛洛霉素A1可使其稳定且与溶酶体标志物LAMP1共定位；3-HPA处理促进其核定位，该修饰对细胞凋亡和周期无显著影响（图4）。
图4.ITGA2B半胱氨酸羧基乙基化诱导溶酶体降解
AS患者血浆抗ITGA2B-ceC96自身抗体水平显著高于健康对照，高抗体者均携带HLA-DRB104等位基因；该肽段脉冲的成熟树突状细胞可显著诱导患者CD4+T细胞增殖，使产IFN-γ的斑点形成细胞数量增加，且HLA-DRB104阳性细胞诱导效果更突出（图5）。
图5.ITGA2B半胱氨酸羧基乙基化诱导CD4+ T细胞相关免疫应答
4.ITGA2B-ceC96肽段被特异性募集至HLA-DRA*01–HLA-DRB1*04复合物的抗原结合槽
荧光偏振实验证实ITGA2B-ceC96（85-98）片段与HLA-DRA01/HLA-DRB104复合物结合力最强且与DC表面HLA-DR共定位；HLA-DR4转基因小鼠免疫该肽段后产生特异性抗体，CD138+浆细胞与IFN-γ+CD4+T细胞比例显著升高，免疫未修饰肽段则无此效应（图6）。
图6.HLA-DR4限制性免疫应答由羧乙基化ITGA2B肽段触发
5.ITGA2B半胱氨酸羧基乙基化与HLA-DRB1*04型强直性脊柱炎患者的自身抗体及T细胞反应相关
103例AS患者中HLA-DRB104等位基因频率33.01%，显著高于健康人群；该基因型患者抗ITGA2B-ceC96抗体水平更高，HLA-B27、HLA-A02与抗体水平无关；其DC经ITGA2B-ceC96脉冲后，可诱导CD4+T细胞高表达CD137、IFN-γ等因子（图7）。
图7.具有特定HLA单倍型的强直性脊柱炎（AS）患者中与ITGA2B-ceC96肽相关的T细胞应答及自身抗体产生
6.ITGA2B-ceC96相关的代谢与免疫改变存在于强直性脊柱炎（AS）、类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）患者以及健康供体中
AS患者PBMC中ITGA2B-ceC96水平、血浆3-HPA浓度和PBMC中CBS水平均显著高于健康对照，RA和SLE患者也存在类似趋势；AS、RA、SLE患者血浆中抗ITGA2B-ceC96自身抗体水平均显著升高；HLA-DRB104/ceC96四聚体阳性T细胞在三种自身免疫病患者中均有检出，且多集中于HLA-DRB104+个体（图8）。
图8.对强直性脊柱炎（AS）、类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）患者及健康对照者（HCs）中ITGA2B-ceC96相关代谢与免疫变化的综合分析
文章小结
半胱氨酸羧乙基化由肠道微生物代谢物3-HPA诱导，可修饰ITGA2B并在强直性脊柱炎中诱导自身抗体和免疫反应。研究建立系统性工作流程鉴定差异修饰蛋白，深化对AS发病机制的理解，可能有助于开发新抗原相关诊断与治疗方案。