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通过分析 TCGA 中 37 种癌症的基因表达，作者证明了 PRR13 在致癌作用中的潜在作用。如图 1A 所示，在非配对样本中，PRR13 在 12 种癌症中的表达与正常组织相比显著升高，包括 BLCA（膀胱尿路上皮癌）、BRCA（乳腺浸润性癌）、CHOL（胆管癌）、ESCA（食管癌）、GBM（多形性胶质母细胞瘤）、HNSC（头颈部鳞状细胞癌）、KIRC（肾肾透明细胞癌）、LIHC（肝肝细胞癌）、 PRAD（前列腺腺癌）、STAD（胃腺癌）、THCA（甲状腺癌）和 UCEC（子宫体子宫内膜癌）（ 图 1A）;而在配对样本中，与正常组织相比，PRR13 在 9 种癌症中的表达显着增加，包括 BLCA、BRCA、CHOL、ESCA、HNSC、LIHC、LUSC、STAD 和 THCA（ 图 1B）。使用 TCGA 数据库，作者比较了 BRCA 与邻近组织之间 PRR13 基因的表达。当进行非配对和配对差异表达分析时，与正常组织相比，在肿瘤中观察到 PRR13 的表达显着更高（ 图 1C，D）。ROC 分析显示，PRR13 mRNA 在 BRCA 中的表达为 0.848（95%置信区间：0.822–0.875）（ 图 1E），PRR13 的临界值设置为 5.782（TPM）。
来自 TCGA 数据的 BRCA 和其他类型人类癌症中的 PRR13 mRNA。来自 TCGA 数据库的不同肿瘤类型中的 PRR13 表达水平，（A） 未配对样本，（B） 配对样本。（C）PRR13 在 BRCA 和正常组织中的表达水平。（D）PRR13 在 BRCA 及其配对邻近组织中的表达。（E）BRCA 中 PRR13 的受试者工作特征分析（ROC）。
在通过基因表达分析确定 PRR13 在致癌作用中的潜在作用后，作者利用 STRING 数据库进一步探索其蛋白-蛋白质相互作用（PPI）网络，以阐明其功能关联。根据 STRING 数据库提供的置信度评分选择了与 PRR13 相互作用的前 50 种蛋白质（图 2A）。随后，作者使用一组 51 个基因（包括 PRR13）进行了富集分析，以深入了解与这些基因相关的生物学过程和途径。富集分析结果如图 2B-E 所示，揭示了与各种生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）和 KEGG 途径的显着关联。在生物学过程中，这些基因与细胞-底物粘附、细胞-基质粘附、整合素介导的信号通路、整合素介导的细胞粘附、白细胞迁移、调节血管生成、调节白细胞迁移、核小体分解、粒细胞趋化性和转化生长因子β激活有关。此外，KEGG 通路的富集分析强调了与 ECM-受体相互作用、粘连斑、PI3K-Akt 信号通路、细胞粘附分子、肝细胞癌、小细胞肺癌、癌症中的蛋白多糖和膀胱癌的显着关联。这些发现为了解 PRR13 及其相关基因在癌症发展和进展中的潜在功能作用和途径提供了宝贵的见解。
PRR13 及其相互作用蛋白的功能见解。（A）PRR13 与 50 个共相互作用蛋白之间的相互作用网络。对 PRR13 和 50 个共作基因进行 GO 和 KEGG 富集分析，显示其生物功能 （B）、 细胞成分 （C）、 分子功能 （D） 和京都基因与基因组百科全书 （E）。
考虑到 GO 和 KEGG 富集分析显示 PRR13 可能参与肿瘤免疫应答，利用 ssGSEA 和 CIBERSORT 进一步分析 PRR13 mRNA 表达与 BRCA 免疫细胞浸润水平的关系。ssGSEA 中免疫细胞浸润与 PRR13 mRNA 表达之间的相关性如图 3B 所示。结果显示，PRR13 mRNA 表达与 NK CD56bright 细胞、嗜酸性粒细胞、Th17 细胞、肥大细胞和 NK 细胞之间存在显著的正相关（p < 0.001）。相反，PRR13 表达与 B 细胞、Tem、Th1 细胞、巨噬细胞、DC、Tgd、T 细胞、aDC 和 Tcm 呈显着负相关 （p < 0.001）。当将 PRR13 表达分为高表达组和低表达组时，作者发现高表达组和低表达组中免疫细胞的比例与图 3A 中 Spearman 相关性中分析的水平相对应。
免疫浸润和 PRR13 表达分析。（A）ssGSEA 算法中 PRR13 高表达组和低表达组免疫细胞浸润水平。（B）ssGSEA 算法中免疫细胞浸润与 PRR13 表达的相关性。（C）CIBERSORT 算法中 PRR13 高表达组和低 PRR13 表达组免疫细胞浸润水平。（D）CIBERSORT 算法中免疫细胞浸润与 PRR13 表达的相关性。
在 CIBERSORT 分析中，PRR13 mRNA 表达与静息肥大细胞、M2 巨噬细胞、中性粒细胞和γ-δ T 细胞呈正相关，与 CD4 记忆激活的 T 细胞、活化的树突状细胞、M0 巨噬细胞和浆细胞呈负相关（p < 0.05），如图 3D 所示。值得注意的是，与低表达组相比，高表达组的 M2 巨噬细胞、静息肥大细胞和γδ T 细胞的比例更高，而 CD4 记忆激活的 T 细胞的比例较低（图 3C）。
在检查了 PRR13 表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性后，作者的研究工作转向在单细胞水平上研究其表达谱和相关途径。通过单细胞分析，作者的目标是阐明 PRR13 在各种细胞类型中表达的动态，并揭示与其表达相关的任何潜在信号通路。对 TISCH 数据库中的各种 BRCA 数据集的分析（Sun 等人，2021 年） 显示，GSE114727 数据集中的 CD4Tconv、Treg、Tprolif、CD8T 和 CD8Tex 细胞中 PRR13 的高表达（图 4C、D）。此外，在 GSE114727、GSE138536 和 GSE143423 数据集中的单细胞/宏细胞中观察到 PRR13 的高表达，在 GSE138536 数据集中观察到上皮细胞的表达升高（图 4A）。图 4B 所示，GSE114727 数据集中细胞的 UMAP 聚类主要由 CD4Tconv、Treg、Tprolif、CD8T 和 CD8Tex 细胞组成。
单细胞基因表达分析。（A） 热图显示了 PRR13 在不同数据集中不同细胞类型中的表达。（B）BRCA 数据集 GSE114727 细胞的 UMAP 聚类。（C）PRR13 在 BRCA GSE114727 数据集中 5 个细胞亚群中的表达。（D）BRCA GSE114727 数据集中 5 个细胞亚群中表达的 PRR13 的小提琴图谱。
为了进一步分析 PRR13 与单细胞水平通路之间的关系，作者分析了 PRR13 在 CancerSEA 数据库中不同数据集中的表达模式（Yuan et al.， 2019）。来自数据集 GSE77308、GSE75688、GSE75367 和 GSE86978 的细胞的 UMAP 聚类分别如图 5A、D、G、J 所示。描述这些数据集中 PRR13 表达的方框图如图 5B、E、H、K 所示。图 5C、F、I、L 显示了描述数据集 GSE77308、GSE75688、GSE75367 和 GSE86978 中细胞分布的 T-SNE 图，每个点代表单个细胞并按 PRR13 表达水平着色。结果显示，GSE77308 和 GSE75688 数据集中几乎所有细胞中 PRR13 的高表达。随后对 PRR13 表达与通路关系的分析显示，PRR13 表达与 GSE77308 炎症、DNA 修复和细胞周期呈正相关（EXPID：EXP0052）;GSE75688 干性（EXPID：EXP0053）;GSE75367 中的 DNA 修复、缺氧、DNA 损伤和细胞死亡 （EXPID： EXP0054）;以及 GSE86978 中的 DNA 损伤、侵袭和 DNA 修复（EXPID：EXP0055）（图 5M）。图 5N 显示了描述 PRR13 表达与 GSE77308 数据集中不同途径之间关系的相关热图，而图 5O 说明了 PRR13 表达与 GSE77308 炎症之间的相关性。
单细胞分析。CancerSEA 数据库中GSE77308（A）、GSE75688（D）、GSE75367（G） 和 GSE86978（J） 细胞的 UMAP 聚类。PRR13 在 GSE77308（B）、GSE75688（E）、GSE75367（H） 和 GSE86978（K） 中表达的框图。T-SNE 描述了细胞在 GSE77308（C）、GSE75688（F）、GSE75367（I） 和 GSE86978（L） 中的分布以及细胞中 PRR13 的表达水平。（M） 不同单细胞数据集中感兴趣的 PRR13 与功能状态之间的相关性。（N）PRR13 表达与 GSE77308 中不同途径的相关性。（O）PRR13 表达与炎症的相关性。
为了确定 PRR13 在乳腺癌中的功能，作者首先通过 RT-qPCR 研究了 PRR13 在 20 个乳腺癌组织和 20 个邻近非癌组织中的表达。结果显示，与邻近非癌组织相比，PRR13 mRNA 在乳腺癌组织中的表达水平升高。（图 6A）。
PRR13 在乳腺癌组织中的表达升高。（A）RT-qPCR 检测 PRR13 在乳腺癌及邻近非癌组织中的表达。（B） 乳腺癌组织中 PRR13 表达的免疫化学分析。PRR13 的阴性染色，（C） 弱阳性染色（+），（D） 阳性染色（++）和 （E） 强阳性染色（+++）的代表性图像。放大倍数为 400×。
3.6 PRR13 过表达与其他临床特征和患者生存率相关
通过 IHC 分析了 160 个主要在 TMA 上组装的标本的 PRR13 蛋白表达。不同的染色强度如图 6B 所示。160 个乳腺癌组织中有 71 个 （44.4%） 显示 PRR13 低表达，而 160 个乳腺癌组织中有 89 个 （55.6%） 显示 PRR13 高表达。160 例患者的临床病理特征见表 1。PRR13 表达与年龄（p = 0.046）、临床分期（p = 0.001）和 N 分类（p < 0.001）显著相关，而 PRR13 高表达组和低表达组之间 T 分类（p = 0.186）、分化（p = 0.200）、ER 表达（p = 0.808）、PR 表达（p = 0.705）和 Her-2 表达（p = 0.472）无统计学差异。（表 1）。Kaplan-Meier 曲线和对数秩检验表明，PRR13 高表达患者的 OS（p = 0.036）比 PRR13 低表达的患者短（图 7A）。单因素分析模型显示，临床分期（HR = 0.595，p = 0.039）、ER 表达（HR = 2.192，p = 0.008）、PR 表达（HR = 2.137，p = 0.011）和 PRR13 表达（HR = 0.449，p = 0.008）对乳腺癌的预后有影响。在多因素 Cox 回归模型中，ER 表达（HR = 2.276，p = 0.006）和 PRR13 表达（HR = 0.502，p = 0.029）是 OS 的独立预后因素。
Kaplan-Meier 生存曲线与对数秩检验对乳腺癌患者。（A） 所有患者中 PRR13 高表达病例与低 PRR13 表达病例的 OS 率，（B） T1-2 级乳腺肿瘤患者中 PRR13 高表达病例与低 PRR13 表达水平病例的 OS 率，（C） T3 级乳腺肿瘤患者中 PRR13 高表达病例与低 PRR13 表达水平病例的 OS 率。（D） 无淋巴转移患者 PRR13 高表达病例与低 PRR13 表达水平病例的 OS 率 （N0），（E） 淋巴转移患者 （N1-3） 高 PRR13 表达病例与低 PRR13 表达水平病例的 OS 率，（F） PRR13 高表达与低 PRR13 表达水平的早期临床病例（I/II 期）的 OS 率 （G） PRR13 高表达晚期病例（III 期）与低 PRR13 表达水平病例的 OS 率，（H） 1 级乳腺肿瘤患者中 PRR13 高表达病例与低 PRR13 表达水平病例的 OS 率，（I）。2-3 级乳腺肿瘤患者中 PRR13 高表达病例与 PRR13 低表达水平病例的 OS 率。
此外，作者分析了 PRR13 在分别按临床分期、T 分型、N 分型和分级分层的选择性患者亚组中的预后价值。对于 T3 亚组患者，PRR13 的表达与 OS 持续时间密切相关（ 图 7C;对数秩检验，p = 0.041），但对于 T1-2 亚组患者则不然（ 图 7B;对数秩检验，p = 0.173）。对于 N1-3 亚组的患者，PRR13 的表达与 OS 持续时间密切相关（ 图 7E;对数秩检验，p = 0.005），但对于 N0 亚组的患者则不然（ 图 7D;对数秩检验，p = 0.878）。PRR13 的表达与 I-II 期亚组（ 图 7F;对数秩检验，p = 0.302）或 III 期亚组（ 图 7G;对数秩检验，p = 0.289）患者的 OS 持续时间相关。当根据 Grade 进行评估时，在高分化肿瘤中，与 PRR13 表达相关的对 OS 的影响仍然没有统计学意义（ 图 7H;对数秩检验，p = 0.637），但显示出与中分化和低分化肿瘤的强关联（ 图 7I;对数秩检验，p = 0.037）。
PRR13 在乳腺癌患者中过度表达，与患者生存率相关。它可以作为乳腺癌患者的有价值的预后指标。
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