《动物模型构建与行为评估》pdf电子版 V1.0

建立孤养动物模型

将16只C57BL/6J雄性小鼠随机分为孤养组（8只）和群养组（8只）。为更好的辨认小鼠及排除小鼠的个体差异性，在购买的小鼠到达实验室后，观察其毛发、眼睛、保证其无异常行为后，给小鼠打好耳标。随后将孤养小鼠单只每笼，群养小鼠四只每笼饲养于安静环境中。期间饲养两周时人为更换一次垫料，其余时间均不打扰。饲养时长满30天后进行行为学实验。

Fig1 行为测试流程图

图A展示的是孤养建模示意图，图B、C、D、E、F、G分别展示的为旷场实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫实验、悬尾实验、糖水实验和社交实验。

行为学鉴别

① 一般状态观察

动物模型构建与评估丨孤养动物模型评估
30天建模完成后，称量小鼠体重，并观察记录小鼠的毛发、状态、有无异常进食行为等。如有小鼠因牙齿发育不良引起的体重过轻或有体态异常（如因肿瘤原因身体有较大隆起），则剔除小鼠，不进行后续实验。其余全部小鼠进行行为学实验。
② 旷场实验    
对孤养和群养小鼠进行旷场实验，测试小鼠的焦虑程度。在实验开始前，先将小鼠放置在行为测试实验室中1小时，让小鼠提前适应环境，避免环境变化带来的陌生感对小鼠行为学上的影响。在此期间，用纸巾蘸取少量75%酒精擦拭好旷场实验箱，晾干5分钟，避免残留酒精气味，强烈的酒精气味会对小鼠行为学产生较大影响。打开电脑，安装好摄像头。实验开始时，抓住鼠尾后三分之一处轻轻提起小鼠，避免小鼠受到惊吓，放入旷场实验箱的正中央并开始计时。摄像机记录6分钟内的小鼠活动情况。行为记录期间避免人员走动和噪音。房间灯光保持昏暗，而测试场地用明亮光线照射。每只小鼠测试完毕后记录耳标号，清洁旷场四壁和底部，防止小鼠气味之间的干扰。统计小鼠的平均移动速度和中央区停留时间。

VisuTrack丨专为动物行为实验开发的先进分析工具

③ 强迫游泳实验
进行强迫游泳实验。将圆柱形烧杯中加入约三分之二的纯净水，烧杯直径12cm，高25cm，测量水温，保证在23-25℃。安装好摄像头，保证录像区域可以涵盖整个小鼠运动范围并且可以清楚看到小鼠行为反应。强迫游泳实验在正常光强下进行。摄像机记录6分钟。测试过程中水深确保小鼠不能够用其后肢接触到烧杯底部，当小鼠在实验过程中出现强烈挣扎的溺水情况时，根据动物伦理应及时将小鼠取出，使用吹风机吹干，再决定是否重新进行实验。实验后统计每一只小鼠在记录时间最后4分钟的僵直不动时长。僵直不动是指小鼠漂浮或者保持身体不动，没有人为可识别的挣扎行为。实验小鼠为保持其头部在水面上所需的运动除外。
④ 高架十字迷宫实验
进行高架十字迷宫实验。实验开始前搭建好高架十字迷宫装置，安装好摄像头，放置于正常光线的房间，保证录像内容可以清楚看到全部测试臂。实验开始将小鼠轻放于高架十字迷宫的中心并开始计时记录。整个记录时长5分钟，要保证在测试过程中不要在测试臂周围走动，避免小鼠感知到实验者的距离从而产生逃避恐惧行为。记录完成后清理装置，记录耳标号并进行下一只小鼠的记录。统计整个5分钟记录时长内每只小鼠在开放臂的总停留时间比以及进入开放臂的次数。    

高架十字迷宫，型号：XR-XG201，上海欣软

⑤ 悬尾实验
进行悬尾实验。同样，安装好悬尾装置和摄像头后，将小鼠的尾巴用双面胶粘于装置悬杆上，使小鼠头部离地面30cm，为避免小鼠爬尾或爬上测试杆影响实验结果，可以在悬挂前将小鼠尾部穿过一小套管，随后再将尾巴悬好。在实验装置的三个腔内分别悬挂一只小鼠，小鼠之间均为隔离状态，没有物理和视觉接触但可以听到声音。记录小鼠8分钟内的挣扎情况。完成试验后清理实验装置，查看耳标进行下面小鼠的测试。统计指标为记录时间8分钟内最后6分钟小鼠的挣扎时间比。
⑥ 糖水偏好实验
进行糖水实验。进行糖水实验前首先需要适应期。在适应期的第一天，使用有标尺的仓鼠喂水瓶装满50ml纯水，并放置在小鼠笼子左右各一侧。在适应期的第二至四天，给小鼠放置两瓶50ml浓度为1%的糖水，糖水由国产蔗糖和纯水按1：100的比例制成。在三天的适应期中，要每天调换两个水瓶的位置。适应期的第五天取走水瓶，将小鼠禁水24h。第六天进行正式实验。实验开始前，将孤养和群养小鼠均放置为单笼一只。并且在鼠笼的左右侧分别给小鼠放置一瓶50ml的纯水和一瓶50ml浓度为1%的糖水，在正式记录开始前分别对纯水和糖水进行称重。要注意水瓶在放入鼠笼时应避免过度用力而泄漏液体，并且保证水瓶放入后不因重力而漏水。实验开始后，总体在黑暗环境中记录2小时，其中在实验进行到1小时时，人为更换两水瓶左右位置。实验结束后，将液体轻轻从笼盖上取下，使用电子秤称量2小时内纯水和糖水的消耗量。统计糖水偏好指数，计算方法为（糖水消耗量/糖水消耗量+纯水消耗量）%。    
⑦ 社交实验
社交实验分为两部分，分别测试小鼠的社会交往能力和社会交往偏好性。社交实验箱分为三个腔室，其中左右腔室分别将放置同类小鼠或物体。实验开始前，将测试小鼠提前放置于行为测试室中熟悉环境，实验所用的小鼠不能与测试小鼠放置于同一环境中，避免前期气味识别带来的熟悉效应。实验开始时，首先将测试小鼠放置于社交实验箱中自由探索5分钟。将与实验小鼠完全陌生的小鼠放置于随后实验中使用的亚克力塑料杯中进行熟悉。探索结束后，使用纸巾蘸取75%酒精清理小鼠气味，随后，分别将刚才的陌生小鼠和物体放置于亚克力塑料杯中，并放在社交实验箱的左腔室和右腔室的同水平位置。塑料杯上有空隙，可以让实验小鼠进行身体上的物理接触。随后将实验小鼠轻轻放置于中间腔室的中心，开始录制小鼠的社交行为，录制时间为10分钟。10分钟后，清理腔室，将物体一侧的亚克力塑料杯内容换为一只新的陌生小鼠，并将左右两个亚克力塑料杯换位置，这意味着上轮实验中的小鼠对实验小鼠来说已经是熟悉者了，新放入的小鼠是完全陌生的，以此来探究实验小鼠的社交偏好性。重新放入实验小鼠后录制10分钟。统计指标分别为社交能力：小鼠和物体所在亚克力塑料杯周围兴趣区的花费时长差异；社交偏好性：陌生小鼠和熟悉小鼠所在亚克力塑料杯周围兴趣区的花费时长差异。    

Fig2 孤养和群养小鼠社交能力表现

图A是孤养小鼠在社交能力测试中的一个示例。图B是对10分钟社交能力测试中孤养小鼠分别在小鼠一侧还有物体一侧花费所时长做出的统计柱状图。结果显示孤养小鼠对物体或同类伙伴的探索没有表现出差异性。图C是群养小鼠在社交能力测试中的一个示例。图D是对10分钟社交能力测试中群养小鼠分别在小鼠一侧还有物体一侧花费所时长做出的统计柱状图。    

Fig2 对前联合皮层进行双光子成像

图A展示的是小鼠在前联合皮层的双光子成像示意图，图B展示的是实验中的一个样例，在成像实验结束后，为确定成像位置的准确性对成像小鼠的脑组织进行形态学连续切片，根据共聚焦显微镜的结果对应脑图谱位置证明成像位置是前联合皮层，因此后续实验结果可信。图C是图B中第三张图片的放大图，展示的是染料扩散的中心位置，一般为实验中的主成像区。

孤养小鼠在前联合皮层放电活动增强：

使用LabVIEW将双光子成像得到的8只孤养和4只群养小鼠分别623和913个神经元自发放电活动的钙信号计算出来，使用Matlab进行钙信号的识别，将神经元细胞在每分钟内发放的次数以及频率百分比作为指标，在Matlab中画取频率分布图。   

Fig3 孤养小鼠前联合皮层中不同的放电信号样例展示
图A展示的是使用双光子钙成像技术分别在孤养小鼠和群养小鼠前联合皮层采集到的单个神经元钙信号，其中孤养或群养组的10个胞体信号来自一个成像面，钙信号由LabVIEW、IgorPro和Adobe Illustrator软件处理而来。图B、C、D、E分别是对其中一些特别的连续放电信号的放大，这些异常活跃的钙信号代表了神经元的异常状态。