大家好，今天跟大家分享一篇题为题为 IRGQ-mediated autophagy in MHC class I quality control promotes tumor immune evasion（MHC I类质量控制中IRGQ介导的自噬促进肿瘤免疫逃逸）主要组织相容性复合体I类（MHC I类）蛋白是适应性免疫反应的关键介质。通过展示抗原肽激活消除带有外源肽的CD8+ T细胞。
01
研究背景
自噬-溶酶体系统指导多种货物的降解，也参与肿瘤进展。在这里，我们表明免疫相关的 GTP 酶家族 Q 蛋白 （IRGQ） 是迄今为止未表征的蛋白质，在主要组织相容性复合物 I 类 （MHC I 类） 分子的质量控制中起作用。IRGQ 通过其与 GABARAPL2 和 LC3B 的结合模式，将错误折叠的 I 类 MHC 引导至溶酶体降解。在没有 IRGQ 的情况下，游离的 MHC I 类重链不仅在细胞中积累，而且还被转运到细胞表面，从而促进免疫反应。由于 CD8+ T 细胞对 IRGQ 敲除肿瘤细胞的反应性增加，患有肝细胞癌的小鼠和人类患者表现出更高的生存率和 IRGQ 水平降低。因此，我们揭示了 IRGQ 作为 MHC I 类质量控制的调节因子，介导肿瘤免疫逃逸。
见图一
IRGQ 是一种自噬受体。
图一
（A） 示意图显示了溶酶体中自噬受体和转运蛋白的鉴定过程。
（B） 蛋白质丰度和代表性高置信度自噬底物蛋白列表差异的热图。
（C） PA-TU-8998T 的 SDS-PAGE 和蛋白质印迹 （WT， FIP200−/−和 ATG-5−/−） 细胞用 EBSS 饥饿 16 小时。使用指定的抗体通过 western blot 分析蛋白质裂解物。
（D） 用 FLAG-IRGQ 转染 HEK293T 细胞，裂解物用于免疫沉淀 （IP），并处理用于 MS。使用 MaxQuant 和 Perseus 分析数据;n = 3。火山图表示对照 IP 上 FLAG-IRGQ 的学生 t 检验差异，以及 FLAG-IRGQ 在对照 IP 上的学生 t 检验 p 值的 −log 值。诱饵 IRGQ 标记为绿色，最重要的交互伙伴GABARAPL2，标记为紫色。所有其他被鉴定为重要相互作用伴侣的蛋白质都用紫色点表示。
（E） 表达 mCherry-IRGQ 的内源性 HA 标记GABARAPL2 或 GABARAPL2 KO HeLa 细胞的免疫荧光。用 BafA1 （200 nM） 在 EBSS 中处理细胞 6 小时。用内源性 LAMP1 和 HA 抗体探测固定细胞。ImageJ 绘图和量化：图 S1H 和 S1I。比例尺：缩放图像中的 10 和 2 μm。
见图二
分离溶酶体中的蛋白质丰度和 IRGQ 表征。
图二
（A-C）火山图显示 （A） WT、（B） ATG5 中 BafA1 处理后溶酶体中蛋白质丰度−/−和 （C） FIP200−/−细胞。x 轴表示相对对数2蛋白质丰度的倍数变化，y 轴表示使用 Perseus 计算的 Welch t 检验值。深灰色蛋白质使用 5% 的 FDR 临界值表示为具有统计学意义的蛋白质。紫色的蛋白质代表自噬底物。
（D） 用 Torin-1 （24 小时，250 μM） 和 BafA1 （24 小时，100 nM） 处理的 PA-TU-8998T 细胞的 SDS-PAGE 和蛋白质印迹。使用指定的抗体通过 western blot 分析蛋白质裂解物。
（E） 用 10 ng/mL IFNγ 处理 24 h 的 HEK293T 和 HeLa 细胞裂解物的 SDS-PAGE 和蛋白质印迹。
（F） 载有 GST 蛋白的斑点印迹和放射自显影αP32GTP 的。
（G） 干扰素诱导型 GTP 酶 1 与 GDP 复合物的叠加以及 IRGQ 的同源模型突出了 IRGQ 中 GDP 结合的关键残基缺失。
（H） IF 图像的 ImageJ 剖面图（图 1E）。IRGQ（红色）仅在用 EBSS 和 BafA1 处理的 WT 细胞的溶酶体（绿色）内积累。
（I） IRGQ 阳性溶酶体的定量（IF 图像，图 1，E）。数据以平均值表示，误差线表示 SD。实验组间差异的统计显着性采用学生 t 检验进行评估。p < 0.05 的差值注记为∗; n = 3。
（J 和 K）内源性 mCherry 标记的 IRGQ HeLa 细胞的免疫荧光。细胞未处理或在 BafA1 （200 nM） 的 EBSS 中处理 4 小时。用 DAPI 、鬼笔环肽和内源性 LC3B （J） 和 LAMP1 （K） 抗体探测固定细胞。比例尺：10 μm。
见图三
IRGQ 降低膜上和细胞内的 MHC I 类水平。
图三
（A） 使用纯化的 His-hATG8 蛋白以及 HCT116 细胞裂解物或纯化的 GST-IRGQ 对体外 His-pull-down 进行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹。
（B） IRGQ 与 GABARAPL2 结合后氘摄取的差异。IRGQ 的相对氘摄取量测量为存在 GABARAPL2 （78% 覆盖率、2.72 冗余、3 分钟暴露）下最大摄取的百分比。将摄取差异（结合 – 对照）映射到全长 IRGQ （AF-A1A4Y4-F1） 的 AlphaFold 模型上，并使用从红色（减少）到白色（不变）到蓝色（增加）的颜色渐变来表示。
（C） IRGQ N 末端结构域 1-184（粉红色）和 IRGQ LIR1 185-190（橙色）与 GABARAPL2（灰色）复合物的结构。此外，对于经典 LIR1 基序相互作用，GABARAPL2 α-螺旋 2 在结构保守的开关 I（部分无序）、开关 II G 蛋白区域以及 LIR1 和 N 末端 G 结构域之间的接头形成的口袋内进行广泛接触。
（D） 使用纯化的 GST-GABARAPL2 和转染 FLAG-IRGQ WT 或 FLAG-IRGQ 突变体的HEK293T细胞裂解物（LIR1 突变体 = F186A L189A，LIR2 突变体 = W421A L424A）对体外 GST 沉降进行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹印迹。
（E） 与 （D） 相同，但使用 GST-LC3B 而不是 GST-GABARAPL2。
（F） LC3B（绿色）与 IRGQ LIR2 肽 （416–425）（蓝色）与 GABARAPL2（灰色）重叠的复合物的结构，以及 IRGQ LIR1 肽 （183–190）（橙色）显示出两种 IRGQ LIR 肽的不同结合模式。
（G） GABARAPL2（灰色）和 LC3B （绿色） α2 螺旋的结构叠加和序列比对。LC3B 的非保守、大块、带电残基（E18、R21 和 E25）以及与 IRGQ D7 羰基氧通过 K20 到 L22 的氢键损失阻止了 LC3B 与 IRGQ 在 N 末端结构域（粉红色）的相互作用。
（H） SDS-PAGE 和体外 GST 沉降的蛋白质印迹使用纯化的指示 GST 蛋白和HEK293T细胞裂解物。
见图四
IRGQ 与 MHC I 类形成复合物。
图四
（A） 使用 SDS-PAGE 和 western blot 使用指定抗体后，将 PA-TU-8988T WT 和 IRGQ KO 细胞分馏到 ER、线粒体和胞质溶胶中。细胞分级分离显示 IRGQ KO 介导的 MHC I 类积累发生在 ER 中。
（B） 互补亲和纯化系统示意图：BiCAP、Vn/Vc Venus。用同型二聚体 Vn/Vc-IRGQ、同型二聚体 HLA-Vn/Vc 和异二聚体 Vn-IRGQ/HLA-Vc 转染的 U2OS 细胞，用 EBSS 处理 1 小时。使用 Leica 共聚焦显微镜 SP8 拍摄代表性荧光图像。比例尺：5 μm。
（C） 用同型二聚体 Vn/Vc-IRGQ 和 BFP-LC3B 转染的 U2OS 细胞，用 EBSS 和 BafA1 处理 6 小时。用抗内源性 LAMP1 （可视化溶酶体） 和 Reep5 （描绘 ER 网络） 的抗体对细胞进行染色。使用 Leica 共聚焦显微镜 SP8 拍摄代表性荧光图像。比例尺：10 μm。
（D） 用异二聚体 Vn-IRGQ/HLA-Vc 和 BFP-LC3B 转染的 U2OS 细胞，用 EBSS 和 lysotracker 处理 1 小时，持续 30 分钟。使用 Leica 共聚焦显微镜 SP8 进行活细胞成像。代表性视频。比例尺：10 μm。
（E） 用异二聚体 Vn-IRGQ/HLA-Vc 或 Vn/Vc-IRGQ 和 HLA-Vn/Vc 的同源二聚体转染的 U2OS 细胞，用 EBSS 和 lysotracker 处理 1 小时，持续 30 分钟。使用 Leica 共聚焦显微镜 SP8 拍摄代表性荧光图像。
见图五
IRGQ 通过自噬降解非构象 I 类 MHC。
图五
（A） 用 BafA1 和 MG132 处理后 PA-TU-8988T WT 和 IRGQ KO 细胞的可溶性和不溶性细胞成分的细胞分级分离 （16 h;分别为 100 和 500 nM）。来自蛋白质印迹的 HLA 水平细胞分级分离的定量（图 S5A）。n = 3。
（B） 从蛋白质印迹（图 S5C）定量 PA-TU-8988T WT 和 IRGQ KO 细胞中 MHC I 类分子的细胞糖基化状态，未经处理或用 MG132 处理后（16 小时;500 nM）。n = 7。
（C） 顺序 HLA-ABC 和 HLA-W6/32 IP 的示意图。
（D） 根据方案 （C） 在 PA-TU-8988T WT 和 IRGQ KO 细胞中使用构象依赖性 HLA 抗体进行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹。
（E） 使用 IgG 对照、HLA-ABC、HLA-W6/32 和 HLA-HC10 抗体对 PA-TU-8988T WT 和 IRGQ KO 细胞进行 FACS 分析。MHC I 类游离重链 （HLA-HC10） 存在于 IRGQ KO 细胞的细胞表面。
（F） 每个条件至少 50 个细胞的 HLA 阳性溶酶体（IF 图像图 S5I）的定量。HeLa WT 和 IRGQ KO 细胞用 EBSS （4 h） 和 BafA1 处理。IRGQ KO 细胞溶酶体中存在较少的 HLA-ABC，而构象 MHC I 类 （HLA-W6/32） 不受影响。用于分析的图像是使用 Leica 共聚焦显微镜 SP8 在 z 堆栈中拍摄的。n = 3。
（G） 与 （F） 相同，但仅在 HeLa WT 细胞或去除 IRGQ、LC3B 和/或 GABARAPL2 的细胞中对 HLA-ABC 进行染色。图 S5J. 中 KO/KD 的验证。IRGQ、GABARAPL2 和 LC3B 都直接用于溶酶体降解的 MHC I 类。
数据以平均值表示，误差线表示 SD。实验组间差异的统计显着性采用学生 t 检验进行评估。
见图六
IRGQ 调节人肝细胞癌和小鼠肝细胞癌中的 CD8+ T 细胞反应。
图六
（A） CD8+ T 细胞浸润肿瘤中 IRGQ mRNA 表达水平高或低的肝癌患者的 Kaplan-Meier 生存图（数据来自 NIH 癌症基因组学中心，癌症基因组图谱计划 [TCGA]）。
（B） c-Myc 的代表性对比增强磁共振成像 （MRI） 图像;Trp53Δ 和 c-Myc;Trp53Δ;质粒注射后 27 天和 41 天的 IrgqΔ 小鼠。箭头表示肿瘤。比例尺：8 毫米。
（C） c-Myc 的 Kaplan-Meier 生存图;Trp53Δ （Irgq WT） 和 c-Myc;Trp53Δ;IrgqΔ （Irgq KO） 与 HCC。
（D） WT 和 Irgq KO 小鼠质粒注射后第 27 天通过 MRI 检测到的相对肝肿瘤面积 （c-Myc;Trp53Δ 与 c-Myc 的对比;Trp53Δ;IrgqΔ）。数据以盒须图表示。
（E） 与 （D） 相同，但评估肿瘤数量。
（F） 用抗 CD8 抗体处理的 Irgq WT 和 KO 小鼠各自的存活天数。第 0 天注射 CRISPR-Cas9 质粒，第 13 天至第 21 天注射 5× 200 μg 抗 CD8 抗体。
（G） 与分离的原代人 CD8+ T 细胞共培养后早期凋亡 PA-TU-8988T WT 和 IRGQ KO 细胞的 FACS 分析。数据以盒须图的形式表示，单个样本采用颜色编码。n = 3。
（H-J）（H） CD25+ FoxP3+ CD4+ T 细胞 （Tregs）、（I） GrB+ 或 IFNγ+ CD8+ T 细胞或 （J） c-Myc 血液中 CD279+ CD8+ T 细胞的 FACS 分析;Trp53Δ 和 c-Myc;Trp53Δ;IrgqΔ 小鼠直至质粒注射后 42 天。数据以盒须图表示，单个供体采用颜色编码。用 Kruskal-Wallis 检验评估实验组间差异的统计学意义。
02
研究结论
总之，我们揭示了 IRGQ 在自噬介导的 MHC I 类分子降解和质量控制过程中作用的分子机制，从而影响 T 细胞免疫。
最后，需要进一步的研究来更好地了解细胞毒性 T 细胞的（新）抗原特异性激活的作用以及卸载和/或错误折叠的 MHC I 类分子对 T 细胞介导的抗癌免疫的影响。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。