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结果：
功能丰富分析
为鉴定牛沙利铂耐药基因，差异分析共识别出 316 个 DEGs（|log2 FC| > 1，P < 0.05 GSE128967），其中 116 个上调，200 个下调（见图 1A，S1）。槲子分析显示，DEGs 在体液免疫反应、含胶原蛋白的细胞外基质和异种生物代谢过程方面得到了丰富（图 1B）。KEGG 结果表明，上调 DEG 主要富集于 toll 样受体信号通路、NF-kappa B 信号通路、ECM 受体相互作用（图 1C， P < 0.05），下调 DEG 主要富集于 PPAR 信号传导和细胞色素 P450 代谢外生体代谢（图 1D， P < 0.05）。GSEA 分析显示，PRG 主要富含凋亡、Ecm、Wnt、NF-kappa B 和 EMT 信号（见图 1E，P.3C 0.05）。
功能丰富分析。注：火山图显示数据集（A）中基因表达差异 GSE128967DEGs 的 GO 分析（B）。KEGG 对上调 DEGs（C）和下调 DEGs（D）进行分析。GSEA 对铂类抗性相关基因（E）的分析
最初通过将 DEG 与 PRG 相交获得 24 个气相聚中的 OXARGs（见图）。阿拉伯数字A，S2）。基于 TCGA-STAD 中的生存数据绘制了这 24 个基因的 KM 曲线，结果显示 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 对患者生存期有显著影响（图 2B）。风险评分基于三个基因的表达确定，TCGA-STAD 患者被分为高评分组（HS）组和低评分组（LS）（见图 2C）。图 2D 显示 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 对风险评分的贡献程度，其中 NOTCH1 对风险评分贡献最大。HS 组患者的总体生存时间短于 LS 组（图 2E），表明风险评分显著影响生存率。
鉴定具有 GC 预后价值的草沙利铂耐药相关基因。注：维恩图显示GSE128967 数据集与铂类抗性相关基因（A）的交汇点。MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5（B）的 Kaplan-Meier（KM）存活曲线。风险评分三重图（C）。ROC 曲线显示 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 对风险评分（D）的贡献。根据风险评分（E）分组后，高风险组（HR）和低风险（LR）组患者的 KM 生存曲线
接下来，作者分析了风险评分与免疫细胞之间的相关性。结果显示，风险评分与多种免疫细胞显著相关，尤其是倾向于免疫抑制的细胞，如 Treg 和 M2 巨噬细胞（见图）。3 此外，HS 组和 LS 组的 GC 患者免疫细胞浸润显著不同，HS 组患者的抗癌免疫细胞浸润减少，如 CD8 + 新生 T 细胞、共同淋巴前体（CLP）细胞和浆细胞，表明 HS 组患者免疫反应能力降低（见图 3B）。此外，作者分析了这三种预后基因与免疫细胞之间的关系（见图 3C）。结果显示，SLC7A5 与 NK 细胞、角质细胞和 MEP 细胞呈显著正相关，与 macrophages_M2、CD4+_naive_T 细胞呈显著负相关。MT2A 与成纤维细胞、cytotoxic_lymphocytes NK_cells 呈显著正相关。NOTCH1 与 NK_cells、细胞周、前脂肪细胞、T_cells 呈正相关，与 CD8+_naive_T 细胞、plasma_cells、Th1_cells 呈负相关。免疫评分热图显示，HS 组和 LS 组不同免疫细胞的免疫评分存在显著差异（图 3D）。
免疫浸润分析。注：免疫浸润评分与风险评分（A）之间的相关性。高分组（HS）组与低分组（LS）组（B 组）免疫细胞浸润情况的比较。三个预后基因与免疫细胞（C）之间的相关性。免疫评分热图可视化了免疫细胞与风险评分（D）之间的相关性
突变分析显示 HS 组和 LS 组之间共有 18 个显著突变基因（S3，P < 0.01），图4A 显示 了突变最显著的前 10 个基因。Oncoplots（图 4B）显示 HS 组的 CNV 突变水平显著高于 LS 组。 其中最显著的差异是 ARID1A（21%/10%）。
CNV 突变分析。注：高分组（HS）和低分组（LS）组（A）中突变最显著的前 10 个基因。肿瘤图显示 HS 组和 LS 组（B 组）CNV 突变水平
MT2A 的药物敏感性（见图）5 本研究通过 oncoPredict 的泛癌数据库预测了 A）、SLC7A5（图 5B）和 NOTCH1（图 5C）。结果显示，只有 NOTCH1 与药物敏感性呈显著负相关。MT2A 和 SLC7A5 可能是 GC 独有的草沙铂耐药基因，因此在泛癌数据库中与药物敏感性无显著相关。此外，LS 组的药物敏感性高于 HS 组（图 5D），风险评分与药物敏感性呈显著负相关（图 5E）。
药物易感性分析。注意 MT2A（A）、SLC7A5（B）和 NOTCH1（C）与药物敏感性的相关性。药物敏感性箱图（D）为高分组（HS）组和低分（LS）组。风险评分与药物敏感性的相关性（E）
验证 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 在草沙利铂耐药 GC 细胞中的表达
生物信息学分析结果表明，风险评分更能反映 GC 患者的预后、免疫浸润、CNV 突变和药物敏感性，表明 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 是 GC 中 oxaliplatin 耐药性的潜在靶点。接着，作者验证了 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 在两种抗草沙铂 GC 细胞 MKN45R 和 HGC27R 中的表达（见图。6A）。CCK8 结果显示，MKN45R 细胞对 24 小时的奥沙利铂处理具有耐药性，浓度约为 8 μg/mL，耐药指数为 1.6（见图 6B）。HGC27R 细胞在剂量为 1 时具有耐药性。6 μg/mL，电阻指数为 4.5（见图 6C）。RT-qPCR（图 6D、E）和 WB（图 6F、G）结果显示，与 MKN45 和 HGC27 细胞相比，牛沙铂耐药细胞中 MT2A 和 SLC7A5 表达水平有所上升，NOTCH1 表达水平显著下降。然而，研究表明 MT2A 是一种致癌基因（Pan 等，2013,2016），这与作者的分析结果不符。 此外，NOTCH1 在气相录中的作用也被更广泛地报道。因此，SLC7A5 最初被纳入该随访研究。
验证 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 在抗性胃癌（GC）细胞中的表达。注：MKN45R 和 HGC27R 电池（A）。不同剂量的奥沙利铂对 MKN45 和 MKN45R 细胞存活率的影响，*P < 0.05，***P < 0.001 vs. 对照组（B）。不同剂量的牛沙利铂对 HGC27 和 HGC27R 细胞存活率的影响，***P < 0.001 vs. 对照组（C）。MKN45、MKN45R、HGC27 和 HGC27R 中 MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 的 mRNA 水平，***P < 0.001 对 MKN45 或 HGC27（D-E）。MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 蛋白在 MKN45 和 MKN45R 细胞中的表达，***P < 0.001 对 MKN45（F）。MT2A、NOTCH1 和 SLC7A5 蛋白在 HGC27 和 HGC27R 细胞中的表达，***P < 0.001 对比 HGC27（G）。每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的恶性过程
sh-SLC7A5 被用于探索 SLC7A5 在对草沙利铂耐药的 GC 细胞中的作用。结果显示，这三种 sh-SLC7A5 均降低了 MKN45R 中 SLC7A5 的表达（见图。7A）和 HGC27R（图 7B）细胞，其中 Y31244 靶具有最佳干扰效果，并被选中进行进一步实验。EDU 染色和克隆实验结果显示，sh-SLC7A5 组的 GC 细胞荧光强度显著低于 sh-NC 组（见图 7C，D），细胞克隆能力显著降低（见图 7E）。此外，细胞迁移能力（图 8A、B）和入侵能力（图 8C、D）在 sh-SLC7A5 组中显著减弱，MMP2 和 MMP9 表达显著下调（图 8E、F）。TUNEL 染色结果显示，sh-SLC7A5 组中 MKN45R（图 9A）和 HGC27R（图 9B）细胞的荧光强度有所增强;WB 结果显示，sh-SLC7A5 组 Bcl-2 表达显著下调，Bax 表达明显增加（见图 9C，D）。
敲低 SLC7A5 抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的增殖。注：MKN45R 细胞中三组 sh-SLC7A5 的干扰效率检测，***P < 0.001 对 MKN45R （A）。检测 HGC27R 细胞中三枚 sh-SLC7A5 的干扰效率，***P < 0.001 对比 HGC27R（B）。EDU 染色检测到 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞增殖的影响，***P < 0.001 vs. sh-NC （C）。EDU 染色检测出 sh-SLC7A5 对 HGC27R 细胞增殖的影响，***P < 0.001 vs. sh-NC （D）。菌落形成检测检测到 sh-SLC7A5 对 HGC27R 和 MKN45R 细胞菌落形成能力的影响，***P < 0.001 vs. sh-NC （E）。每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的侵入和迁移。注：伤口愈合测定检测到 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（A）和 HGC27R 细胞（B）迁移的影响。Transwell 检测检测了 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（C）和 HGC27R 细胞（D）侵入的影响。西方印迹法检测到 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（E）和 HGC27R 细胞（F）中 MMP2 和 MMP9 表达的影响。P < 0.001 vs. sh-NC。每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 促进了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的凋亡。注：TUNEL 染色检测到 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（A）和 HGC27R 细胞（B）凋亡的影响。西方印迹法检测到 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（C）和 HGC27R 细胞（D）中 BCL2 和 Bax 表达的影响。P < 0.001 vs. sh-NC。每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的糖解作用
肿瘤细胞中观察到的 Warburg 效应表现为葡萄糖摄取增加和糖酵解活性增强。这一现象与胃癌的发生、扩散、转移、治疗耐药性及不良预后密切相关（Liu 等，2019）。因此，作者考察了 SLC7A5 敲低对 HGC27R 细胞和 MKN45R 细胞中葡萄糖转运相关蛋白表达的影响。结果显示，敲低 SLC7A5 显著降低 MKN45R 细胞（图 10A）和 HGC27R 细胞（图 10B）中 HK2、LDHA、Glut1 和 PDK1 的表达。此外，敲低 SLC7A5 导致 MKN45R 和 HGC27R 细胞上清液中的葡萄糖水平显著升高，乳酸水平显著下降（见图 10C）。最后，敲低 SLC7A5 显著降低了 MKN45R 和 HGC27R 细胞中的 ECAR（图 10D、E）和 OCR（图 10F、G）。结果显示，敲低 SLC7A5 显著降低了线粒体呼吸储备能力，并抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的糖酵解作用。
敲低 SLC7A5 抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的糖解作用。注：西方印迹法检测到 sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（A）和 HGC27R 细胞（B）中 HK2、LDHA、Glut1、PDK1 表达的影响。酶联免疫吸附测定检测细胞外葡萄糖水平和细胞外乳酸水平（C）。sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（D）和 HGC27R 细胞（E）细胞外酸化速率（ECAR）的影响。sh-SLC7A5 对 MKN45R 细胞（F）和 HGC27R 细胞（G）中氧气消耗率（OCR）的影响。P < 0.001 vs. sh-NC。每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 通过抑制糖酵解作用抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的恶性过程
为了澄清 sh-SLC7A5 对草沙铂耐药 GC 细胞恶性进展的影响是否与糖酵解作用的抑制有关，随访研究中使用了不同剂量的谷胱甘肽。结果显示，加入 5 mM 和 10 mM 谷胱甘肽显著促进了增殖（见图）。11 与 sh-SLC7A5 组相比，MKN45R 和 HGC27R 细胞的克隆形成（图 11C、D）、迁移（ 图 12A、B）和 入侵（图 12C， D）能力，并上调了 MMP2 和 MMP9 的表达（图 12E， F）。此外，谷胱甘肽显著降低了 MKN45R 细胞（图 13A）和 HGC27R 细胞的凋亡水平（图 13B），上调了 Bcl-2 的表达，并下调了 Bax 的表达（见图 13C，D）。
敲低 SLC7A5 通过抑制糖酵解，抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞的增殖。注：EDU 染色检测到 MKN45R 细胞（A）和 HGC27R 细胞（B）的增殖。菌落形成检测检测了 MKN45R 细胞（C）和 HGC27R 细胞（D）的菌落形成能力。P < 0.001 对比对照组;##P < 0.01， ###P < 0.001 vs. sh-SLC7A5.每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 通过抑制糖酵解作用，抑制 MKN45R 和 HGC27R 细胞的侵入和迁移。注：伤口愈合检测检测到 MKN45R 细胞（A）和 HGC27R 细胞（B）的迁移。Transwell 检测到 MKN45R 细胞（C）和 HGC27R 细胞（D）的侵袭效应。Western blot 检测法检测到 MKN45R 细胞（E）和 HGC27R 细胞（F）中 MMP2 和 MMP9 的表达。P < 0.001 对比对照组;##P < 0.01， ###P < 0.001 vs. sh-SLC7A5.每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 通过抑制糖酵解促进 MKN45R 和 HGC27R 细胞的凋亡。TUNEL 染色检测到了 MKN45R 细胞（A）和 HGC27R 细胞（B）的凋亡。西方印迹法检测到 MKN45R 细胞（C）和 HGC27R 细胞（D）中 BCL2 和 Bax 的表达。P < 0.001 对比对照组;#P < 0.05， ##P < 0.01， ###P < 0.001 vs. sh-SLC7A5.每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 抑制了 MKN45R 和 HGC27R 细胞在体内的生长及糖酵解相关蛋白表达
活体实验结果显示，sh-SLC7A5 组小鼠的肿瘤体积和体重显著减少（见图）。14A， B），表明敲低 SLC7A5 抑制了体内 MKN45R 和 HGC27R 细胞的生长。此外，sh-SLC7A5 组 MKN45R（见图 14C）和 HGC27R（见图 14D）肿瘤组织中 HK2、LDHA、Glut1 和 PDK1 的表达水平显著降低。
敲低 SLC7A5 抑制了体内 HGC27R 和 MKN45R 细胞的生长及糖酵解相关蛋白表达。注：不同治疗组（A）中小鼠肿瘤组织大小。不同治疗组（B）中小鼠的体重、肿瘤组织体积和肿瘤体重。在小鼠肿瘤组织中 MKN45R 细胞（C）和 HGC27R 细胞（D）中的葡萄糖转运相关蛋白 HK2、LDHA、Glut1、PDK1 的表达。P < 0.001 对抗控制组。每个实验重复三次
敲低 SLC7A5 增强了 MKN45R 和 HGC27R 细胞在体外和体内对草黄素的敏感性
最后，作者观察到 SLC7A5 敲低后 HGC27R 和 MKN45R 细胞对奥沙利铂的敏感性。CCK8 结果显示，0.5 μg/mL 的奥沙利铂在敲低 SLC7A5 后，显著降低了 HGC27R 和 MKN45R 细胞的存活率，相较于 sh-NC 组（见图）。15 答）在敲低 SLC7A5 后，HGC27R 和 MKN45R 细胞系的耐药指数分别为 0.7 和 0.6。体内，SLC7A5 的敲低和奥沙利铂的给药相比单用奥沙利铂显著减少了小鼠肿瘤体积和重量（图 15C， D）。这表明，敲低 SLC7A5 增强了 MKN45R 和 HGC27R 细胞在体外和体内对奥沙利铂的敏感性。
敲低 SLC7A5 增强了 HGC27R 和 MKN45R 细胞在体外及体内对草沙利铂的敏感性。注：不同剂量的奥沙利铂对 HGC27R 和 MKN45R 细胞存活率的影响，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 vs. sh-NC（A）。不同治疗组（B）中小鼠肿瘤组织大小。不同治疗组小鼠的体重、肿瘤组织体积和肿瘤重量，分别为 *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 对比 HGC27R + 奥沙利铂或 MKN45R + 奥沙利铂（C）。每个实验重复三次。
总结
敲低 SLC7A5 通过抑制糖酵解作用，抑制恶性进展并减弱对氯化石蛋白的抗性。
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