3.1. 在 LUAD 和正常组织之间进行 RBPs 的差异表达分析
首先，作者使用 TCGA-LUAD 和 GEO （GSE10072）数据集进行差异表达基因分析。作者的研究结果揭示了 TCGA-LUAD 中 5403 个独特表达的基因，并生成了相应的火山图谱（ 图 1A）。同时，在 GSE10072 数据集中鉴定出 1486 个差异基因，并生成了火山和热图（ 图 1B，C）。随后，作者分析了这些差异基因与 RBPs 的交集，最终鉴定出 38 个差异表达的 RBP（ 图 1D）。在此基础上，作者采用 STRING 数据库和 Cytoscape 软件（3.9.1 版）（由美国加利福尼亚州圣地亚哥 NIGMS 国家普通医学科学研究所提供）构建了 PPI 网络。该网络的目的是说明 29 个基因的相互作用谱（ 图 1E）。此外，作者对 38 个 RBP 应用了单变量 Cox 回归分析，发现其中 8 个与 LUAD 的预后有显著关系（ 图 1F）。最后，通过整合 PPI 网络分析和单因素 COX 回归分析的结果，作者确定了 6 种既是 DEGs 又与肺腺癌预后相关的 RBP——IGF2BP3、SNRPE、GAPDH、MRPL12、MRPL15 和 INTS8，其中 IGF2BP3 差异表达最多（ 图 1G）。为了进一步探索 IGF2BP3 在 LUAD 组织中的表达谱，作者最初利用单细胞数据集 GSE131907 进行分析。通过这种方法，作者成功地解析了 13 个不同的细胞簇，并将它们分为八种主要细胞类型，如 B 细胞、T 细胞和上皮细胞（ 图 1H）。 接下来，作者分析了健康组织和癌组织中的 IGF2BP3 表达，发现与正常样本相比，肿瘤中的表达水平显着更高（ 图 1I-K）。这表明 IGF2BP3 在肺腺癌的发生和进展中可能至关重要。
在 LUAD 和正常组织之间进行 RBPs 的差异表达分析。（A-C） 火山图和热图图说明了表征的差异表达基因 （DEG）。（D）维恩图说明了 RBP、TCGA 和 GSE10072 数据集之间的交集基因。（E） STRING 数据库用于创建 PPI 网络。（F）单变量 Cox 回归确定了交集基因集中的预后基因。（G）维恩图说明了 PPI 网络节点和单变量 Cox 回归分析中的交集基因。（H）t-SNE 图说明了不同聚类的分布和注释。（I-K）IGF2BP3 在正常上皮细胞和肿瘤上皮细胞中的表达和分布。p < 0.001。
3.2. LUAD 中 IGF2BP3 表达与临床特征之间的关联
作者通过对 IGF2BP3 表达的全面评估，检查了 IGF2BP3 表达与 LUAD 患者临床特征之间的联系。作者利用了来自 TCGA 的转录组学数据，并通过对 GSE10072 数据集以及组合 TCGA + GTEX 数据集的分析对此进行了补充。结果表明，与正常组织相比，配对肺腺癌组织中 IGF2BP3 表达显着上调（图 2A）。此外，在 LUAD 组织中，与正常肺组织相比，IGF2BP3 水平明显更高（图 2B-D）。为了进一步验证这一发现，作者从另外两个数据集（GSE32863 和 GSE75037）中提取数据进行分析，结果与上述发现一致（图 S1A，B，D，E）。值得注意的是，IGF2BP3 水平显示出与肿瘤进展阶段的联系（图 2E）。随后的分析表明，被诊断患有中晚期肺腺癌的个体的 IGF2BP3 水平显着升高，与疾病早期阶段的人形成鲜明对比。此外，T2 期和 T3-4 期患者的表达水平高于 T1 期患者的表达水平（图 2F），这一结果与 GSE32863 数据集中的结果一致（图 S1C）。此外，晚期淋巴结转移与 IGF2BP3 表达有关（图 2G）。为了进一步评估 IGF2BP3 的临床意义，作者进行了生存分析。本研究利用 TCGA 数据集和组合的 TCGA + GTEx 数据集，结合预后信息。 研究结果表明，与 IGF2BP3 表达升高的患者相比，表现出 IGF2BP3 水平降低的 LUAD 患者的总生存期显着延长（图 2H，I）。为了证实这些发现，作者进行了 qRT-PCR 和蛋白质印迹来测量不同细胞类型 IGF2BP3 mRNA 和蛋白质水平。数据显示，与正常支气管上皮细胞相比，LUAD 细胞系中的 IGF2BP3 显着上调（图 2J-L）。此外，免疫组织化学染色进一步表明，LUAD 组织中的 IGF2BP3 染色强度明显高于正常肺组织，反映了 LUAD 中 IGF2BP3 表达的增加（图 2M）。总的来说，这些结果表明 LUAD 中的 IGF2BP3 表达与患者预后呈负相关，并可能作为潜在的预后标志物和治疗靶点。
LUAD 中 IGF2BP3 表达与临床特征之间的关联。（A）在个体患者的成对正常组织和癌组织中检查 IGF2BP3 水平。（B-D）IGF2BP3 所有可用正常和肿瘤样本的表达。（E-G） 根据肿瘤分期、T 分期、淋巴结转移状态分类的样本中的 IGF2BP3 表达。（H，I） 生成 Kaplan-Meier 曲线以评估高 IGF2BP3 表达组和低表达组之间的生存差异，按中位水平分类。（J）与 LUAD 系相比，支气管上皮细胞中的 mRNA 水平 IGF2BP3。（K，L） 分析支气管上皮细胞和肺腺癌细胞系中的 IGF2BP3 蛋白水平。（M）利用人类蛋白质图谱（HPA）数据库中的数据评估 IGF2BP3 蛋白在 LUAD 组织和正常肺组织中的表达。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001;NS：不重要。
在这项研究中，作者使用 R 中的“rms”包，整合了与生存时间、生存状态和六个临床特征相关的数据。然后使用 Cox 回归分析构建列线图，以评估这些特征在 476 例队列中的预后意义。如图 3A 所示，总分是通过将图中六个指标水平对应的患者分数相加得到的，可以使用底部提供的量表来评估患者的生存率。模型的总体一致性指数（C-index）为 0.68（95%CI：0.63–0.73，p = 2.11 × 10−12），每个变量对生存的影响通过线段的长度可视化。 结果表明，IGF2BP3 表达是影响肿瘤特异性生存的重要因素。此外，绘制校准曲线以评估预测模型的准确性（图 3B）。该模型展示了 LUAD 预后预测的前景。通过在 R 中使用 pROC 包的 ROC 曲线分析来评估预测性能，AUC 值和置信区间以 1 年、3 年和 5 年为间隔计算（图 3C）。结果表明，该模型的曲线下面积（AUC）指标在 1 年、3 年和 5 年间隔内分别为 0.70、0.71 和 0.73，显示了其强大的预测性能。重要的是，IGF2BP3 表达本身表现出显着的独立预后价值（AUC = 0.63），可与关键临床参数（T 分期= 0.65，N 分期= 0.63，分期= 0.69）相媲美，并且它集成到复合风险评分模型中显着提高了预测准确性（AUC = 0.72）超过任何单个变量（图 S1F）。根据中位表达水平，参与者被分为高表达和低 IGF2BP3 表达队列。数据强调，与高表达的个体相比，IGF2BP3 表达较低的个体的生存期明显更长（图 3D）。此外，作者进一步探讨了 IGF2BP3 表达与 LUAD 患者临床特征之间的相关性。根据中位表达阈值将患者分为高表达组和低 IGF2BP3 表达组。数据显示，LUAD 患者中较高的 IGF2BP3 水平与更晚期的肿瘤分级、较晚的临床分期和淋巴结转移增加之间存在明显而有意义的联系（表 1，图 3E）。这些发现表明 IGF2BP3 可能与 LUAD 的进展和预后有关。
预后建模和 IGF2BP3 的临床价值。（A）开发包含 IGF2BP3 表达和多个临床变量的预后列线图。（B）评估预后模型在估计生存结果方面的精度的校准曲线。（C） ROC 曲线描绘了预测 LUAD 患者 1、3 和 5 年总生存率的 AUC。（D） Kaplan-Meier 分析评估了高风险和低风险患者组之间的生存差异，根据中位风险评分进行分类，对数秩检验显示显着差异 （p < 0.001）。（E）临床特征热图。* p < 0.01，** p < 0.01。
3.4. 下调 IGF2BP3 抑制 LUAD 细胞增殖并促进细胞死亡
为了研究 IGF2BP3 在 LUAD 中的作用，作者采用小干扰 RNA （siRNA） 选择性敲低 PC9 和 H1650 细胞系中的 IGF2BP3。通过 qRT-PCR（图 4A）和蛋白质印迹（图 4B，C）确认敲低效率。功能测定表明，敲低 IGF2BP3 显着降低 LUAD 细胞活力，如 CCK8 增殖测定所示（图 4D）。流式细胞术分析表明，敲低 IGF2BP3 显着提高了细胞灭亡率（图 4E，F）并触发了 PC9 和 H1650 细胞系的 G2 / M 期细胞周期停滞（图 4J 和图 S1F）。此外，通过 qRT-PCR 和 Western blot 分析评估细胞凋亡相关基因 BIM、BAX 和 BCL-2 的表达。结果表明，敲低 IGF2BP3 增加 BIM 表达，从而促进 LUAD 细胞的凋亡（图 4G-I 和图 S3A，B）。此外，伤口愈合测定表明，沉默 IGF2BP3 显着损害了 LUAD 细胞迁移（图 4K，L）。随后，在 BIM 特异性 siRNA 抑制 BIM 表达后，作者成功逆转了 PC9 和 H1650 细胞系中 IGF2BP3 敲低引起的 BIM mRNA 的上调（图 S3C，D）。BIM 的敲低部分抵消了 IGF2BP3 敲低引起的癌细胞细胞凋亡增加（图 S3E）。综上所述，作者的研究结果表明，敲低 IGF2BP3 抑制 LUAD 细胞增殖和迁移，诱导 G2/M 期细胞周期停滞并增强细胞凋亡，从而强调 IGF2BP3 在 LUAD 进展中的潜在参与。
IGF2BP3 的下调抑制 LUAD 细胞增殖并促进细胞死亡。（A-C）IGF2BP3 siRNA 转染 PC9 和 H1650 细胞后，通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹评估 IGF2BP3 mRNA 和蛋白质表达。（D）敲低后评估细胞活力 IGF2BP3。（E，F） 对转染 IGF2BP3 siRNA 的 PC9 和 H1650 细胞进行流式细胞术分析，以测量细胞凋亡。（G-I） 抑制 IGF2BP3 后，通过 qRT-PCR 和 Western blot 分析细胞凋亡相关基因的 BIM 和 BCL-2 表达水平。（J）通过流式细胞术分析转染 IGF2BP3 siRNA 的 PC9 和 H1650 细胞，以评估细胞周期分布。（K，L） 使用伤口愈合测定评估细胞迁移。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001;ns，不重要。
3.5 高 IGF2BP3 和低组中 DEGs 的富集分析
利用 TCGA-LUAD 数据集，以中位表达水平为阈值，将患者分为高 IGF2BP3 表达组和低表达组，并进行差异表达分析。随后生成了火山图和热图（图 5A，B），作者最初筛选出与 IGF2BP3 表达相关的差异基因。随后，使用 R 包“WGCNA”建立共表达网络来识别与 IGF2BP3 表达相关的基因模块。通过软阈值筛选，β = 10 被确定为构建无尺度网络的最佳参数（图 5C，D）。在优化 WGCNA 参数后，作者使用系统发育树来描绘共表达模块（图 5E），并最终识别出八个模块，计算其特征基因与 IGF2BP3 表达之间的相关性（图 5F）。为了验证结果，作者使用单独的数据集 GSE10072 重复分析，并获得了相关性最高的模块，包含 648 个基因（图 S2A-F）。接下来，作者通过将高 IGF2BP3 表达组和低表达组与 WGCNA 共表达网络模块中最相关的基因相交，鉴定了高表达组和低表达组之间差异上调的基因。使用维恩图，作者确定了 20 个交集的 DEG（图 5G）。这些基因可能在 LUAD 细胞的生长中具有重要的调节作用。随后，作者对这组 20 个基因进行了基因本体 （GO） 富集分析，发现了与关键生物过程的显着关联。这些包括减数分裂细胞周期中 G2/M 期的进展以及有丝分裂细胞周期中从中期到后期的过渡。 研究结果强调了这些基因在细胞周期调节、有丝分裂姐妹染色单体分离和核染色体分离中发挥的关键作用（图 5H）。此外，KEGG 分析显示细胞周期中差异表达基因的显著通路富集（图 5I）。这些发现表明 IGF2BP3 可能通过调节细胞周期相关基因来影响 LUAD 的进展。为了探索 LUAD 中 IGF2BP3 的功能机制，作者进行了 GSEA。结果表明，IGF2BP3 高表达组的细胞周期相关通路显着富集，富集了 HALLMARK_G2M_CHECKPOINT 和 等HALLMARK_MYC_TARGETS_V1通路（图 5J）。相反，IGF2BP3 低表达组在脂质代谢相关途径中表现出显着富集，包括 HALLMARK_FATTY_ACID_METABOLISM 和 HALLMARK_ADIPOGENESIS（图 5K）。这些结果表明，IGF2BP3 可能通过调节细胞周期相关基因来促进肿瘤细胞增殖，而其低表达可能通过影响脂质代谢途径来抑制肿瘤进展。总之，IGF2BP3 通过调节细胞周期和代谢途径，可能对肺腺癌的发展至关重要。
高 IGF2BP3 组和低组 DEGs 的富集分析。（A）火山图，说明了基于 IGF2BP3 表达水平的 LUAD 中差异表达基因。（B）热图说明了高表达与低 IGF2BP3 表达组中的差异表达基因（DEG）。（C）在多个软阈值功率（β）下评估无尺度拓扑拟合指数。（D）评估各种软阈值功率（β） 的平均连通性。（E）显示基因表达模块的分层聚类树状图，每种颜色代表一个不同的基因模块。（F）使用 Pearson 相关性评估模块特征基因与 IGF2BP3 表达之间的关系。（G）维恩图，描绘了与 WGCNA 相关的 TCGA、GSE10072 和 DEGs 的上调基因的交集。（H）描绘 20 个 DEG 的基因本体 （GO） 富集分析的 Circos 图，突出显示显着富集的术语。（I）20 个 DEGs 的 KEGG 通路富集分析环形图，具有显著富集项。（J）基因集富集分析（GSEA）显示 HALLMARK 基因集样本富high-IGF2BP3-expressing集。（K） GSEA 显示 HALLMARK 基因集中样本的low-IGF2BP3-expressing富集。
3.6. LUAD 中 IGF2BP3 与免疫细胞浸润之间的关联
为了探索 IGF2BP3 水平与免疫景观之间的关系，对 LUAD RNA-seq 数据集进行了 ssGSEA;然后，作者筛选了 32 种丰度为 > 0 的免疫细胞类型，并评估了它们的浸润水平（图 6A）。差异和相关性分析表明，两种类型的肿瘤浸润免疫细胞（TIC）与 IGF2BP3 表达显著相关。具体而言，Th2 细胞与 IGF2BP3 表达呈正相关，而 CD4+ 效应记忆 T 细胞 （Tem） 与 IGF2BP3 表达呈负相关（图 6B-G 和图 S4A-C）。这些发现表明，IGF2BP3 表达水平显着影响 TME 内的免疫细胞浸润。值得注意的是，Th2 细胞能够促进 TME 中的免疫逃逸，而 CD4+ Tem 则发挥抗肿瘤作用[18,19]。 接下来，作者通过使用 GSEA 比较高表达组和低表达组来研究 IGF2BP3 在肿瘤免疫微环境中的作用。研究结果表明，与 CD4+ Tem 细胞相关的基因显著下调，而 Th2 细胞相关基因在高 IGF2BP3 表达组与低表达组相比表现出显著的上调（图 6H）。这一发现表明，IGF2BP3 可能通过调节这些免疫细胞的功能来促进肿瘤免疫逃逸。基于这一发现，作者计算了肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE） 评分，该评分通过分析肿瘤样本的基因表达谱来评估免疫逃逸的可能性。TIDE 评分降低表明患者的肿瘤免疫逃逸风险较低，免疫治疗反应潜力较高[20]。 作者的分析表明，与 IGF2BP3_high 相比，IGF2BP3_low 的 TIDE 评分明显较低（图 6I）。这表明患者的低 IGF2BP3 水平可以提高免疫治疗效果。总的来说，这些结果凸显了 IGF2BP3 在塑造 TIME 中的潜在作用，并为制定 LUAD 患者的免疫治疗策略提供了理论基础。
LUAD 中 IGF2BP3 与免疫细胞浸润之间的关联。（A）堆叠条形图，说明 LUAD 肿瘤样本中 32 个肿瘤浸润免疫细胞的比例。（B）描述肿瘤浸润淋巴细胞与 IGF2BP3 表达之间相关性的热图，其中每个颜色方块代表相应的相关值。（C，D） 箱线图说明了 LUAD 样品中肿瘤浸润免疫细胞的分布，按 IGF2BP3 表达水平分层。红色框表示 TCGA 和 GSE10072 数据集中都出现的免疫细胞类型，并显示出显着差异。（E，F）IGF2BP3 表达与 Th2 细胞以及 CD4+ Tem 细胞之间的相关性分析。（G）维恩图显示表现出差异表达并与 IGF2BP3 相关的免疫浸润细胞。（H）来自 MSigDB 数据库 C7 集合的 GSEA 结果。（I）高 IGF2BP3 表达组的 TIDE 评分。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001;NS：不重要。
3.7. 高低 IGF2BP3 表达的 LUAD 患者的药物敏感性分析
为了评估 IGF2BP3 在药物治疗中的作用，作者使用 R 包“oncoppredict”分析了 LUAD 药物敏感性。数据包括 513 个 TCGA 样本和 58 个 GSE10072 LUAD 样本。结果显示，9 种 TCGA 和 4 种 GSE10072 药物对 IGF2BP3 表达降低的患者更有效，表明这些药物可能具有更好的疗效（图 7A，B）。随后，使用维恩图对共敏药物进行 TCGA 和 GSE75037 数据集的分析，并筛选出一种共享药物 BI-2536（图 7C）。为了进一步评估 BI-2536 与 IGF2BP3 的结合潜力，作者使用 AutoDock 进行了分子对接分析。结合亲和力反映了配体与受体结合的能力，绝对值越高表示结合能力越强。BI-2536 与 IGF2BP3 之间的结合能计算为-7.55 kcal/mol，表明两者的结合具有良好的结合潜力。分子对接的 3D 模型由 PyMol（2.6.0 版）绘制（图 7D）。综上所述，BI-2536 可能为低 IGF2BP3 表达的 LUAD 患者提供增强的治疗效果，为临床用药决策和治疗精准度的提高提供了重要依据。这些发现为为低 IGF2BP3 表达的 LUAD 患者创建个性化治疗提供了新的见解和理论框架，特别是在免疫和药理学方法方面。
高低 IGF2BP3 表达 LUAD 患者的药敏性分析。（ 甲 、 乙 ）使用 TCGA 和 GSE75037 数据分析肺腺癌病例的药物反应性。（C）维恩图显示了 TCGA 和 GSE75037 数据集之间对 IGF2BP3 敏感的药物的交集。（D）IGF2BP3 与 BI-2536 的分子对接模型。** p < 0.01，*** p < 0.001。
总结
总之，作者的研究强调了 IGF2BP3 在 LUAD 进展中的关键作用，强调了其作为预后标志物和治疗靶点的潜力。实验数据表明，敲低 IGF2BP3 显着抑制肺腺癌细胞的增殖，增强细胞凋亡，并诱导 G2/M 期细胞周期停滞。此外，高 IGF2BP3 表达与晚期肿瘤分期、细胞增殖增加以及通过调节肿瘤免疫微环境进行免疫逃逸有关。相反，低 IGF2BP3 表达预示着更好的免疫治疗反应和对 BI-2536 的潜在敏感性。因此，IGF2BP3 可以成为个性化治疗的一个有前途的靶点，为 LUAD 治疗中的精准医学提供新的策略。
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