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本研究共从 3 个正常肺组织样本和 3 个 PAH 肺组织样本中提取的 20,035 个细胞被归类为 15 种主要细胞类型（见图）。1 图 S1B 显示了每种细胞类型的主标记基因。在正常肺组织和受 PAH 影响的细胞中，都观察到相当程度的异质性（见图）。1B），表明 PAH 肺腔内微环境发生了显著变化。报告显示 NK 细胞表现出 PAH 细胞毒性降低的表型转变[8]。然而，该疾病环境中 NK 细胞的其他表型尚未被充分探索。共计 952 个 NK 细胞被分为 7 个不同的亚群体（见图。1 分析结果显示，来自不同组的 NK 细胞根据其起源表现出显著的异质性（图）。1 利用 NK 细胞代表性基因进行相关分析，发现这 7 个 NK 细胞亚群可细分为 4 个主要功能亚群（见图）。1E，F）。显示了 4 个主要功能亚群的前 10 个标记基因。对这四个亚群标记基因的通路富集显示，NK1 细胞主要负责细胞因子分泌并发挥细胞毒性功能;NK2 细胞主要参与 IL2 和 IL6 的分泌;NK3 细胞参与 ATP 代谢和细胞骨架运输，而 NK4 细胞则参与 ATP 合成和蛋白质稳定性调控（见图）。1G).PAH 患者及对照组单细胞分辨率下肺组织的自然状态。 答 ：三名 PAH 患者和三名对照组的肺组织细胞被聚类为 15 种主要细胞类型，并在 UMAP 图中可视化。每个点代表一个单元格，按单元类型着色。肺组织中的 B 细胞分布，包括 PAH 患者或对照组，并以 UMAP 图可视化。C NK 细胞分为七个亚群。D 肺 NK 细胞的分布来自 PAH 患者或对照组。NK 细胞子集和之间的 E 相关性在热图中可视化。红色代表高相关性，蓝色代表低相关性。F NK 细胞根据相关性被聚集为四个 NK 功能亚型。不同 NK 亚型中的 G 富集 GO 生物过程。红色条表示较低的 P 值，蓝色条表示较高的 P 值MCT 诱导 PH 大鼠及对照组肺组织中的 NK 细胞景观共计 22,161 个来自 6 只对照组和 6 只 MCT 诱导 PH 大鼠肺组织中的细胞被归类为 16 种主要细胞类型（见图）。2A 和图 S2 A）并按组可视化（图。2B）为标注细胞类型，图 S2B 中显示了前 3 个标记基因。其中，2,063 个 NK 细胞被细分为 4 个不同的亚群（见图）。2 与人类数据相反，MCT-PH 大鼠的肺 NK 细胞与对照组的 NK 细胞之间没有显著异质性（见图。2 基于特征基因的相关分析，NK 细胞进一步分为 3 个功能亚组（见图）。2E，F）。 显示了 3 个功能亚集的前 10 个标记基因。这些功能亚组表现出不同的作用：NK1 主要参与细胞粘附和凋亡通路，NK2 主要参与 NF-kappaB 信号传导和程序性细胞死亡，而 NK3 主要负责细胞激活和穿孔素介导的细胞毒性（见图）。2G).MCT 诱导大鼠模型和单细胞分辨率对照组的肺组织 NK 景观。 答 ：6 只 MCT 诱导 PH 大鼠和 6 只对照组肺组织中的所有细胞聚集于 16 种主要细胞类型，并在 UMAP 图中可视化。每个点代表一个单元格，按单元类型着色。来自 MCT 诱导 PH 大鼠或对照组在肺组织中的 B 细胞分布。C NK 细胞聚集成四个群。D MCT-PH 大鼠或对照组肺 NK 细胞的分布。NK 细胞子集和之间的 E 相关性在热图中可视化。红色代表高相关性，蓝色代表低相关性。F NK 细胞根据相关性被聚集为三个 NK 亚型。G GO 生物过程显示 NK 亚型的功能富集。红色条表示较低的 P 值，蓝色条表示较高的 P 值PH 和 TCF7 中应激 NK 细胞升高会影响 NK 功能在肿瘤中，慢性缺氧激活 NK 细胞的应激反应，导致 NK 细胞功能受损，进而使肿瘤微环境中的肿瘤细胞更易免疫逃逸[10]。与癌症类似，慢性缺氧状态也会触发 PH 的形成。因此，每个 NK 细胞的应激评分基于应激相关基因的表达计算[10]。PAH 组的 NK 细胞表现出高于对照组的应激评分（图。3A），这表明 NK 细胞在 PAH 微环境中表现出应激反应的表型转变。细胞毒性显著下降（见图 S3A）及炎症反应变化甚微（见 S3B）也证明了这一点。细胞毒性和炎症性细胞因子的分泌也是 NK 细胞的重要表型[10， 25]。NK 细胞在缺氧条件下的应激反应增强可能影响细胞毒性。与 NK3 或 NK4 相比，NK1 和 NK2 的应力评分均高得多（见图。3B），进一步表明 NK1/2 与肺血管重塑进展之间存在相关联系。接着，作者根据中位应激分数对 NK 细胞进行了分化，结果发现 TCF7 在差异表达基因中超过了所有基因，在高应激细胞中远高于低应激细胞（见图）。3 与 TCF7-NK 细胞相比 ，TCF7+ NK 细胞表现出更高的应激得分（见图）。3D）以及较低的细胞毒性评分（见图 S3C）。在 MCT 治疗组中，NK 细胞的应激反应在人类肺组织中有所升高（见图。 3G），而细胞毒性降低（见图 S4 A），两组间炎症反应无显著差异（见图 S4B）。NK 细胞功能亚群 NK2 和 NK3 的应激评分升高（见图）。3 对照组 Tcf7 压力评分呈上升趋势（见图）。3E，图 S3E，F），以及肺部 PH 患者的 NK1 和 NK2（见图）。3F）。这表明高表达 TCF7 的 NK1 和 NK2 细胞可能是对应激反应的一种 NK 细胞。TCF7 与 NK 细胞中应激反应的关联。 对照组或 PAH 患者的肺 NK 细胞压力评分（n=3）。B 肺组织中每个人类 NK 细胞亚型的压力评分。C 前十名压力相关基因区分低应激和高应激 NK 细胞;红色代表高表达，蓝色代表低表达。D TCF7 缺失或表达 NK 细胞的压力评分。对照组或 PAH 患者的 E 肺 TCF7 表达水平（n=3）。对照组或 PAH 患者的四个 NK 细胞亚簇的 FTCF7 表达水平。蓝色表示表达水平升高，灰色表示表达减少或缺失。对照组或 MCT-PH 大鼠肺 NK 细胞的 G 压力评分（各 n=6）。肺组织中每大鼠 NK 细胞亚型的 H 应激评分。I Tcf7 缺失或表达 Tcf7 的 NK 细胞的压力评分。J 肺 Tcf7 转录水平来自对照组和 MCT-PH 组。对照组和 MCT-PH 组的 K 肺 Tcf7 蛋白水平。对照组或 MCT-PH 大鼠三个 NK 细胞亚群的 L 肺 Tcf7 表达水平。数据代表 SEM±平均值。* P < 0.05，与对照组进行无配对 t 检验或 Mann-Whitney 检验分析。Kruskal-Wallis 法用于三组及以上组的比较与人类肺组织的发现一致，MCT 治疗组 NK 细胞的应激反应升高（见图。3G），而细胞毒性降低（见图 S4 A），两组间炎症反应无显著差异（见图 S4B）。NK 细胞功能亚群 NK2 和 NK3 的应激评分升高（见图）。3 尽管未达到统计学显著性（见图）。3Tcf7 阳性 NK 细胞的细胞毒性评分显著降低（见图 S4 C），而炎症反应评分在各组间无差异（见图 S4D）。MCT 诱导 PH 大鼠在 mRNA 和蛋白质水平下，Tcf7 在肺组织中的含量远高于对照组（见图）。3J， K，图 S4E， F），以及啮齿动物 PH 模型中单细胞水平的肺 NK2/3 亚型（见图。3L).TCF7 调控 NK 细胞的应激反应人类 PAH 组共有 23 个与应激相关的基因被上调（见图。4A），以及 19 个与应激相关的基因在表达 TCF7 的 NK 细胞中上调（见图。4 值得注意的是，若干热休克相关蛋白的表达水平升高，因此作者选择了四个表达水平较高的基因进行进一步验证。NK 细胞从 Tcf7 敲除小鼠及其对照组的脾脏中提取。TCF7 缺乏表现为 TCFKO NK 细胞蛋白质水平下降约 75%（图）。4C，D）。用于基因验证的体外实验示意图见图。4E。Hsp90aa1 和 Hsp90ab1 在 Tcf7WT NK 细胞中的含量远高于 Tcf7KO NK 细胞（见图）。4F、G 和图 S5 A、B），而两组之间 Hsph1 和 Hsp90b1 无显著差异（见图 S5 C， D）。一致地，在大鼠 NK 细胞功能亚组 NK1 和 NK2 中，应激相关基因在单细胞水平上被上调（见图 S5E）。此外，Tcf7KO NK 细胞在 24 小时缺氧后表现为 HSP90 下调，相较于 Tcf7WT NK 细胞（见图）。4 与体外数据一致，Tcf7KO 小鼠肺 NK 细胞中也检测到 HSP90 的下调（见图）。4 然而，在 4 周缺氧后，Tcf7KO 小鼠与 Tcf7WT 小鼠的 NK 细胞在血液或脾脏蛋白水平的 HSP90 含量并未显著差异（见图 S6 A， B）。这些发现表明，TCF7 可能通过调控肺微环境中 HSP90 表达来调控 NK 细胞的应激反应。TCF7 可能作为 NK 细胞对应激反应的调节剂。 答 ：PAH 患者或对照组肺 NK 细胞中应激相关基因的表达。圆圈大小表示表达感兴趣基因的细胞比例，从浅灰色到蓝色填充颜色表示从低到高的归一化表达水平。B 人类肺部 TCF7 或 TCF7+ NK 细胞中应激相关基因的表达。C 流式细胞术代表性直方图，显示 Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠中分离脾脏 NK 细胞的 Tcf7 表达。D Tcf7+ NK 细胞在所有 Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠中占比例（每组 n=6）。E 这是用于在 Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠中分离的脾脏 NK 细胞基因验证的体外实验示意图。F Hsp90aa1 mRNA 在 Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠在缺氧暴露或常氧条件下分离的脾脏 NK 细胞中表达 24 小时（n=3 只小鼠/组，重复 3 次实验）。在缺氧暴露或常氧条件下，Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠的脾脏 NK 细胞中 G Hsp90ab1 mRNA 表达 24 小时（n=3 只小鼠/组，重复 3 次实验）。H 在缺氧暴露或常氧状态下 24 小时内，Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠中 Hsp90+ NK 细胞的比例（n=4/组，重复 2 次实验）。 I 在缺氧挑战后第 28 天或环境空气中，Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠肺部 NK 细胞中 Hsp90 表达量化（每组 n=4）。数据表示 SEM 平均±。* P < 0.05， *** P < 0.001， **** P < 0.0001 与对应对照组的对比，由 分析，由单向方差分析分析TCF7 通过上调 NK 细胞分泌 SPP1，促进 PASMs 的增殖和迁移与对照组相比，PAH 对肺组织中 NK 细胞对 PASMs 的信号更多（见图。5 值得注意的是，表达 TCF7 的 NK 细胞在 PH 中与 PASMCs 的 SPP1 整合素相互作用显著增强，相较于 TCF7 缺失的细胞（见图）。5B），这表明 TCF7 可能通过 SPP1 介导的整合素受体作用，影响 NK 细胞与 PASMC 之间的细胞通信，可能改变 PASMC 表型。为验证该假设，NK92 细胞先被 TCF7 过度表达的瘦病毒（LV-TCF7）或对照的瘦病毒（LV-Con）感染，随后暴露于缺氧。缺氧水平通过 HIF1 A mRNA 表达水平验证（见图 S7 A-C）。研究显示，感染 LV-TCF7 的 NK92 细胞在蛋白质水平上的 SPP1 表达高于感染 LV-Con 的 NK92 细胞（图）。5 研究发现，hPASMCs 在用 LV-TCF7 感染的 NK92 细胞上清液处理后，其细胞存活率和增殖率比用 LV-Con 感染的 NK92 细胞上清液处理的细胞更具提升（见图）。5D，E）。此外，LV-TCF7 感染 NK92 细胞中用上清液处理的 hPASMCs 迁移能力也高出 2.5 倍（图）。5F).TCF7 通过上调 NK 细胞分泌 SPP1，促进 PASMs 的增殖和迁移。 答 ：来自数据集 GSE228644 的人类样本肺组织中 NK 细胞与单细胞间的交叉话语。B TCF7 缺失的 NK 细胞/SMCs 和表达 TCF7 的 NK 细胞/SMC 中的配体-受体对。通信概率指细胞类型间特定配体-受体相互作用发生的可能性。红点表示更高的通信概率（更强的相互作用）;蓝点表示概率较低（相互作用较弱）。在暴露 48 小时缺氧后，LV-TCF7 或 LV-Control 感染的 NK92 细胞中 C SPP1 和 TCF7 蛋白表达（一次实验 n=3/组，重复 2 次实验）。D hPASMCs 在接受 NK92 细胞培养基（CM）处理后，结合 48 小时缺氧暴露（一项实验 n=6/组，重复 4 项实验）后 hPASMCs 的细胞存活性。E 对 NK92 细胞感染 LV-TCF7 或 LV-Control 并进行 48 小时缺氧暴露（n=3/组，重复 3 次实验）中 hPASMCs 细胞增殖能力的代表性图像和量化。F 对感染 LV-TCF7 或 LV-Control 的 NK92 细胞，配合 48 小时缺氧暴露（n=3/组，重复 3 次实验）中 hPASMCs 在治疗 CM 后 hPASMCs 的相对迁移率的代表性图像和定量。数据代表 SEM±均值。** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001 与对照组进行无配对 t 检验分析。LV-TCF7：携带 TCF7 基因序列的慢病毒。LV-Con：携带空载体的慢病毒TCF7 过表达在 MCT-PH 模型中汇聚血管重塑接着作者研究了 TCF7 在 pH 发生中的作用。实验示意图见图。早上 6 点。气管内输送后，AAV6-hTCF7 大鼠肺部转录水平 TCF7 表达增加了约 10 倍，见图 S8 A 和 S8B。随后确定了 AAV6-hTCF7 大鼠对 MCT 挑战（60 mg/kg）的易感性。AAV6-hTCF7 大鼠右心室收缩压显著升高（见图。6B），平均肺动脉压（见图。6C），以及富尔顿指数（图。6D）与 AAV6 对照组大鼠在 MCT 给药后 3 周进行比较。此外，TCF7 促进了肺动脉重塑，导致肺动脉内侧层增厚（见图。6E、F）以及血管周围胶原蛋白的更丰富的沉积（见图。6G、H），以及更严重的肺血管肌肉化，表现为完全肌肉化血管比例更高（见图）。6I， J）与 MCT 诱导后第 3 周的 AAV6 对照大鼠进行比较。此外，接受 AAV6-hTCF7 的 MCT 处理 PH 大鼠肺部 HSP90+ NK 细胞比例高于 AAV6 对照组，MCT 给药后 6K， L）。接受 AAV6-hTCF7 大鼠肺部蛋白水平的 SPP1 和 TCF7 表达也较 AAV6 对照组在 MCT 给药后有所增加（见图。6M、N、O）。TCF7 过表达加剧 MCT-PH 大鼠模型中的血管重塑。 答 ：实验设计概述。B RVSP（n1=6，n2=6，n3=8，n4=9）;（C）mPAP（n1=6，n2=6，n3=7，n4=6）和（D）富尔顿指数 （n1=6，n2=6，n3=9，n4=11），均来自 AAV6-hTCF7 治疗或 AAV6 对照大鼠，在 MCT（60 mg/kg）或生理盐水注射后第 21 天。E 代表性 EVG 染色图像及 （F）定量介质厚度，针对 AAV6-hTCF7 或 AAV6-对照组受者在 MCT 或生理盐水注射后第 21 天（n1=6，n2=6，n3=9，n4=11）;比例杆：50 微米。G 代表性图像：MCT 或生理盐水注射后第 21 天，AAV6-hTCF7 或 AAV6-对照组受者胶原蛋白丰度的 Masson 染色及（H）定量（n1=5，n2=5，n3=9，n4=11）;比例杆：50 微米。I 在 MCT 或生理盐水注射后第 21 天，AAV6-hTCF7 或 AAV6-对照组受者肺组织中，双重免疫荧光染色及（J）定量α-SMA（平滑肌细胞）和 vWF（内皮细胞）的代表性图像（n1=6，n2=6，n3=10，n4=12）;比例杆：50 微米。多重免疫荧光染色测定的代表性图像，以及（L）定量 AAV6-hTCF7 或 AAV6-对照组在 MCT 或生理盐水注射后第 21 天肺组织中 Hsp90+NK 细胞在所有 NK 细胞中比例的（n1=5，n2=5，n3=5，n4=5）;比例杆：20 微米。 M MCT 注射后第 21 天，AAV6-hTCF7 或 AAV6-对照组受者肺组织中 TCF7 和 SPP1 蛋白水平的代表性图（n3=5，n4=5）。 数据代表 SEM±均值。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001 与指示组相比，采用单向方差分析（One-Factor Anava）或未配对 t 检验分析。 n1、n2、n3 和 n4 表示 Con-AAV6-Ctrl、Con-AAV6-hTCF7、MCT-AAV6-Ctrl 和 MCT-AAV6-hTCF7 组中的老鼠数量，分别TCF7 过表达在缺氧-PH 模型中汇聚血管重塑AAV6-hTCF7 大鼠在缺氧暴露后 3 周内，右心室收缩压（图 S9A）、平均肺动脉压（图 S9B）和富尔顿指数（图 S9C）显著高于 AAV6 对照组。同样，TCF7 还加剧肺血管重塑，表现为肺动脉内侧层更厚（见图 S9D、E）和胶原蛋白沉积更丰富（见 S9F、G），以及在缺氧挑战后第 3 周接受者中，完全肌肉化血管比例更高（见图 S9H、I）。此外，接受 AAV6-hTCF7 给药的缺氧诱导 PH 大鼠肺部中，HSP90+ NK 细胞比例也更高（见图 S9 J， K）。接受 AAV6-hTCF7 的老鼠在缺氧暴露后肺部 SPP1 和 TCF7 蛋白水平高于 AAV6 对照组（见图 S9L， M， N）。TCF7 缺乏有助于缓解由缺氧诱导的小鼠 PH 模型中的血管重塑实验设计如图所示。上午 7 点。在他莫昔芬腹腔注射后，Tcf7 敲除小鼠肺部 Tcf7 表达显著下降，见图 S10。Tcf7KO 小鼠在缺氧后第 28 天时，血流动动力学受损和右心室肥大改善，表现为 RVSP 和富尔顿指数低于 Tcf7WT 小鼠（见图）。7B，C）。与过度表达实验不同，TCF7 敲除在缺氧条件下改善了肺动脉重塑，导致内侧层变薄（见图。7D、E）以及血管周围胶原蛋白沉积减少（图。7F，G），以及完全肌肉化血管比例较低（见图。7H，I）。此外，TCF7 敲除导致表达 HSP90 的 NK 细胞比例下降（见图。7J， K）。TCF7 敲除导致小鼠肺组织中 SPP1 和 TCF7 在蛋白质水平下的表达降低（见图。7L、M、N）。所有研究结果都表明，TCF7 缺乏可能导致 NK 细胞在 PH 微环境中的应激水平和 SPP1 蛋白水平降低。Tcf7 敲除可缓解缺氧诱导小鼠模型中的血管重塑。 答 ：实验设计概述。B RVSP（n1=7，n2=5，n3=7，n4=9）和（C）富尔顿指数（n1=8，n2=9，n3=7，n4=7），均来自缺氧或常氧后第 28 天的 Tcf7WT 或 Tcf7 KO 小鼠。D Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠缺氧或正常缺氧后第 28 天的 EVG 染色代表性图像及（E）介质厚度定量（n1=7，n2=7，n3=9，n4=9）;比例杆：50 微米。F 缺氧或正常氧饱后第 28 天 Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠的 Masson 染色代表性图像及（G）胶原蛋白丰度定量（n1=7，n2=7，n3=9，n4=9）;比例杆：50 微米。H 缺氧或正常氧饱和症后第 28 天，Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠肺组织中双重免疫荧光染色及（I）平滑肌细胞α-SMA 和内皮细胞 vWF 的定量代表性图像（n1=7，n2=7，n3=9，n4=9）;比例杆：50 微米。J 多重免疫荧光染色测定的代表性图像，以及（K）定量 Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠肺组织中 Hsp90+NK 细胞在所有 NK 细胞中比例的代表性图像，时间为缺氧或正常营养后第 28 天（n1=5，n2=5，n3=5，n4=5）;比例杆：20 微米。 L 缺氧后第 28 天，Tcf7WT 或 Tcf7KO 小鼠肺组织中 TCF7 和 SPP1 蛋白水平的代表性图像（n3=5，n4=5）。数据代表 SEM±均值。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001 与指示组相比，均值为单因子方差分析（One-Factor Ananova）或未配对 t 检验。 n1、n2、n3 和 n 4 表示 Nor-Tcf7WT、Nor-Tcf7KO、Hx-Tcf7WT 和 Hx-Tcf7KO 组中的小鼠数量，分别。 总结 总之，TCF7 是影响 NK 细胞行为和血管重塑的关键因素。理解这些关系为通过免疫细胞功能调控改善 PH 的新型治疗方式铺平了道路。
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