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通过多个公共数据库对 CRC 中 NMB 表达模式进行了全面分析。初步检查 TCGA 数据显示，肿瘤组织中的 NMB mRNA 水平显著升高，高于正常对照组（p < 0.001，图 1A，B）和配对副癌组织（p < 0.001， 图 1C）。这些发现得到了独立 GEO 数据集的进一步证实，这些数据集在多个 CRC 队列中持续显示 NMB 过表达（p < 0.001， 图 1D-H ）。利用人类蛋白图谱（HPA）数据库进行蛋白质水平验证显示，与健康结直肠组织相比，CRC 标本中 NMB 的表达显著增加（ 见图 1I，J），总体确立了 NMB 作为 CRC 中显著上调的标志物。数据库中 NMB 表达的分析。肿瘤泛癌中 NMB 的表达，来源于 TCGA 数据库（A）。NMB 的相对表达水平在 TCGA 数据库（B） 中发现了 44 例正常病例和 568 例 CRC 组织。与配对的副癌组织（C） 相比，肿瘤组织中的 NMB 表达升高。基于 GEO 数据库中 8 个数据集的 NMB 表达差异分析，包括 GSE9348（D）、GSE20482（E）、GSE21510（F）、GSE23878（G）、GSE32323（H））。 免疫组织化分析显示，在 HPA 数据库中，CRC 组织中 NMB 的表达高于正常结直肠组织（I， J） *P<0.05;**P<0.01;P<0.001。为评估 NMB 的预后显著性，采用 Kaplan-Meier 方法进行了生存分析。TCGA 数据集分析显示 NMB 表达升高与整体生存期降低之间存在显著关联（p < 0.001，图 2I），这一趋势在 GEO 数据集中持续观察到（ 图 2A-H）。对这些结果进行荟萃分析显示，风险比（HR）为 1.0459（95% CI：1.0067-1.0865，z = 2.31，p = 0.0211），森林图可视化确认 NMB 为 CRC 高风险预后标志物（ 见图 2J）。整体荟萃分析估计 HR 为 1.05（95%置信区间：1.01-1.09），支持 NMB 在 CRC 进展中的作用。NMB 表达与预后及临床特征的相关分析。基于 GEO 数据库中的八个数据集进行生存分析，包括GSE17536（A）、GSE17538（B）、GSE29623（C）、GSE38832（D）、GSE40967（E）、GSE71187（F）、GSE87211（G）、GSE103479（H） 和 TCGA 数据库 （I））。 结直肠癌 （J） 患者预后的荟萃分析。NMB 表达的 ROC 曲线，1、3、5 年时 NMB 的 AUC 分别为 0.622、0.576 和 0.669（K）。TCGA（L， M） 中的单变量和多元 cox 回归分析。*P<0.05;**P<0.01;P<0.001。NMB 的诊断评估通过 ROC 曲线分析进行，纳入 44 个正常样本和 568 个肿瘤样本的表达数据。AUC 值显示 NMB 具有诊断潜力，AUC 在 1 年时为 0.622,3 年时为 0.576,5 年时为 0.669（见图 2K），显示其在 CRC 检测和监测中的显著诊断价值。在严格的质量控制措施下，排除了临床数据不完整或模糊的病例，对 472 名结直肠癌（CRC）患者进行了全面的生存分析。初步单变量 Cox 回归分析发现了若干显著的预后指标（图 2L），包括：晚期年龄（HR = 1.039,95% CI：1.017-1.062，p < 0.001）、晚期肿瘤分期（HR = 2.293,95% CI：1.794-2.932，p < 0.001）、更高睾酮分类（HR = 2.890,95% CI：1.887-4.427，p < 0.001）、淋巴结转移（HR = 2.073,95% CI：1.606-2.675，p < 0.001）， 远处转移（HR = 4.512,95% CI：2.888-7.049，p < 0.001），以及 NMB 表达升高（HR = 1.046,95% CI：1.005-1.088，p = 0.027）。多变量 Cox 回归分析，调整了潜在的混杂因素，显示出三个独立的整体生存期（OS）降低的预测因子（见图 2M）：年龄（HR = 1.470,95% CI：1.025-2.113，p < 0.001）、T 分类（HR = 1.733,95% CI：1.068-2.813，p = 0.026）以及高 NMB 表达（HR = 1.054,95% CI：1.008-1.102，p = 0.021）。这些结果表明，即使控制了既定的临床参数，NMB 表达仍保持其预后意义，表明其在 CRC 风险分层中具有作为补充生物标志物的潜在作用。为阐明 NMB 在 CRC 中的功能意义，作者采用了多模态实验方法。qRT-PCR 分析显示肿瘤组织中 NMB mRNA 相较匹配的副癌变对照显著上调（见图 3A）。通过西部吸迹法进行蛋白质水平验证，发现 CRC 标本中的 NMB 表达明显高于正常结直肠黏膜（见图 3B）。NMB 表达升高，表明结肠癌患者的预后较差。通过 qRT-PCR 和西方栓分析了结直肠癌和正常结直肠组织中 NMB 的差异表达（n=6，p<0.001）（A， B）。 组织中 NMB（C-E） 的免疫组化分析。通过 ELISA（F） 检测到 NMB 在组织均质物和血清样本中的表达。对 61 名 CRC 患者 （G） 进行 KM 曲线分析。临床特征相关分析（H-K）。 对结直肠癌患者 （L-M） 的单变量和多因子 COX 分析。对 61 例 CRC 病例组织微阵列的免疫组化检测显示，NMB 蛋白在细胞质中定位为主，肿瘤组织中染色率显著高于正常对照组（p < 0.001）。结直肠癌组织与邻近非肿瘤组织的比较分析证实了这种过度表达模式（p < 0.001）（图 3C-E ）。组织均质菌（p< 0.001）和血清样本（p < 0.001）的 ELISA 定量进一步证实结肠癌患者 NMB 水平升高（见图 3F）。使用 Kaplan-Meier 方法进行生存分析显示，高 NMB 表达与显著降低的总体生存率相关（见图 3G）。相关研究发现 NMB 表达水平与关键临床病理参数（包括肿瘤分化、T 期、N 期及复发状态）之间存在显著关联（图 3H-K ）。但未观察到与患者年龄、性别或肿瘤直径的显著相关性。单变量和多变量 Cox 回归分析均确立了 NMB 表达作为 CRC 整体生存率的独立预后指标（见图 3L、M）。利用 Cox 回归分析，作者构建了一个包含 NMB 表达水平的 CRC 预后模型，并确定了包括年龄、性别、TNM 分类和肿瘤分期在内的临床参数。该模型表现出稳健的预测表现，情调指数（C 指数）为 0.79（95%置信区间：0.73-0.84，p< 0.001）。风险分层分析显示患者风险评分分布清晰，按低风险到高风险分类（见图 4A）。后续使用 Kaplan-Meier 方法的生存期分析证实，高风险组的总体生存率显著降低（见图 4B）。预后模型的构建。高风险和低风险 CRC 患者风险评分分布（A）。K-M 曲线显示，高风险结直肠癌患者的 OS（OS）显著低于低风险患者（P <0.001）（B）。 根据结目图计算每个 CRC 患者的得分，加法后获得的总分可预测 1 年、3 年和 5 年生存概率 （C）。 该计时图（D） 的 1 年、3 年和 5 年校准曲线。1 年、3 年和 5 年计式组图的 ROC 曲线（AUC = 0.81/1 年，AUC = 0.82/3 年，AUC = 0.84/5 年）（E）。为提升临床适用性，作者基于预后模型开发了全面的通年计图（见图 4C）。该图形工具使临床医生能够计算个体患者得分，并在 1 年、2 年和 3 年间隔估计生存概率，从而支持个性化治疗决策。通过校准曲线验证了该命名图的预测准确性，显示预测与观察到的生存率在 1、2 和 3 年间高度吻合（见图 4D）。ROC 曲线分析进一步证实了模型强大的预测能力，1 年、2 年和 3 年生存预测的 AUC 分别为 0.81、0.82 和 0.84（见图 4E）。为阐明 NMB 在 CRC 中的功能意义，作者系统评估了其体外表达及生物学效应。进行了 qRT-PCR 和西方印迹分析，以评估正常结肠黏膜细胞及一组 CRC 细胞系的内源性 NMB 水平。结果显示表达模式多样，HCT116 细胞 NMB 水平最高，其次是 SW480 细胞中度表达，HT29、CaCo2 和 SW620 系表达极少。在功能特性分析方面，作者利用特定的 shRNA 构造在 HCT116 细胞中建立了稳定的 NMB 敲低，其中 shRNA-NC 为负对照。转染后 48 小时进行的 Western blot 验证确认了有效的 NMB 抑制效果。功能性分析显示，NMB 的耗竭显著损害了细胞增殖，这一点在 MTT 检测中，菌落形成能力下降（图 5A）和代谢活性下降（见图 5B）为证据。验证 NMB 在体外 CRC 调控中的作用。NMB 调控 CRC 细胞的增殖、迁移和侵入。克隆实验分析 （A）。CCK-8 测定分析 （B）。 伤口愈合测定 （C） 的实验分析。迁徙与入侵的实验分析 （D）。*P<0.05;**P<0.01;P<0.001。进一步研究显示，NMB 敲低显著降低了 HCT116 细胞的迁移潜能，这一点通过伤口愈合测定和 Transwell 迁移测试量化。此外，NMB 抑制显著降低了细胞侵入性，通过 Transwell 入侵测定（图 5D）测量。这些发现共同表明，NMB 在促进 CRC 细胞增殖、迁移和入侵方面起着关键作用。肿瘤微环境（TME）已成为多种恶性肿瘤临床结局的关键决定因素，包括乳腺癌（11）、卵巢癌、结肠癌和胃癌。为探讨 NMB 在 CRC 中的免疫学意义，作者对其与 免疫细胞浸润的关联进行了全面分析。免疫细胞群体的初步定量显示患者样本间存在明显特征（图 6A）。NMB 表达与 CRC 免疫浸润之间的关系。每个样本中的免疫细胞数量（A）。 免疫细胞鉴别分析结果。绿色代表低表达组，红色代表高表达组 （B）。NMB 与 T 细胞 CD8（R=0.24，p<0.001）、T 细胞 CD4 未激活（R=-0.14，p=0.014）、T 细胞 CD4 静止记忆（R=-0.14，p=0.011）、T 细胞 CD4 记忆激活（R=0.16，p=0.0029）、T 细胞滤泡辅助（R=0.19，p<0.001）、巨噬细胞 M1（R=-0.13，p=0.017）和巨噬细胞 M1（R=0.12，p=0.026） （C）; 两个测试结果（D） 的交点。6 个免疫细胞的炎症水平与 CRC（E） 中 NMB 副本数之间的关系。*P<0.05;**P<0.01;P<0.001。NMB 表达水平与免疫细胞浸润的比较分析显示，多个免疫细胞亚型存在显著差异。具体来说，CD8+ T 细胞（p < 0.001）、静息记忆 CD4+ T 细胞（p = 0.023）、活化 NK 细胞（p = 0.029）和 M0 巨噬细胞（p = 0.016）在高低 NMB 表达基之间表现出不同的浸润模式（见图 6B）。相关分析进一步发现 NMB 表达与多免疫细胞群体之间的显著关联，包括与 CD8+ T 细胞的正相关（R = 0.24，p < 0.001）、活化记忆 CD4+ T 细胞（R = 0.16，p = 0.0029）和滤泡辅助 T 细胞（R = 0.19，p < 0.001），以及与初学 CD4+ T 细胞的负相关（R = -0.14， p = 0.014）、静息记忆 CD4+ T 细胞（R = -0.14，p = 0.011）以及 M0 巨噬细胞（R = -0.13，p = 0.017）（见图 6C）。这些分析的整合揭示了三种与 NMB 表达一致相关的关键免疫细胞类型：CD8+ T 细胞、静息记忆 CD4+ T 细胞和 M0 巨噬细胞（见图 6D）。此外，对 NMB 突变变异体的研究显示，它们对六种主要白细胞群体的浸润模式有影响，包括 B 细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞（见图 6E）。这些发现共同表明 NMB 在调节 CRC 肿瘤微环境中的免疫浸润中发挥着重要作用。为阐明 NMB 在 CRC 中的免疫作用，作者利用 TIMER 数据库对其与免疫细胞浸润的关联进行了全面分析。该研究涵盖了广泛的免疫标志物，包括 T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞、单核细胞、中性粒细胞、NK 细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、M1/M2 巨噬细胞以及树突状细胞。此外，作者还研究了功能性 T 细胞亚组，特别是 Th1、Th2、Treg、Tfh、Th17 以及耗尽的 T 细胞。作者的分析显示，NMB 表达水平与多种免疫细胞类型中的免疫标志物集之间存在显著关联。在调整肿瘤纯度后，作者发现了与结直肠癌中 NMB 表达相关的不同免疫标志谱。在结肠癌中，以下标志物显示出强烈相关性（P < 0.001;相关系数≥ 0.40）：CD3E、HLA-DPB1、CD3D、CD79A、TGFB1、CD2、HLA-DPA1、ITGAX、HLA-DRA、CD86、CCR7、CD19、NRP1、HAVCR2、CTLA4 和 TBX21。同样，在直肠癌中，CD3E、HAVCR2、IL10、CD1C、CEACAM8、CCR7、STAT3、CTLA4、ITGAM、HLA-DPB1、FOXP3、CCL2、KIR3DL1 和 STAT1 均有显著相关性（P< 0.001;Cor 值≥0.40）。这些发现表明 NMB 表达与 CRC 中免疫标志物的关联模式明显，暗示其在调节 CRC 亚型肿瘤免疫微环境中可能发挥作用。新兴证据表明，泛素特异性蛋白酶（USPs）是 TME 中免疫细胞功能和反应的关键调控因子（12， 13）。具体来说，泛素特异性蛋白酶 21（USP21），作为 USP 家族的重要成员，被认为参与调节 CRC 中 TME 动态（14）。鉴于 NMB 与 CRC TME 之间的已知关联，作者假设 NMB 与 USP21 之间存在潜在的调控关系。实验验证显示结直肠癌组织中 USP21 表达显著升高（见图 7A）。值得注意的是，USP21 沉默导致 NMB 蛋白水平显著下降（见图 7B）。为阐明 NMB 调控的潜在机制，作者采用了针对不同蛋白降解途径的药物抑制剂。蛋白酶体抑制剂 MG132 的治疗有效挽救了由 USP21 敲低引起的 NMB 下调，而自噬抑制剂氯喹（CQ）则无显著效果（见图 7C）。USP21 调控 NMB 的泛素水平。西部印迹显示，USP21 CRC 组织中的表达高于健康结直肠组织（n=6，p<0.001）（A）。 在敲低 USP21 后，NMB 表达在 HCT116 细胞中下降（n=6， p<0.001）（B）;在 HCT116 细胞中，MG132 可逆转敲低 USP21 诱导的 NMB 表达下降，但 CQ 无影响 （C）。Co-IP 建议 USP21 可能与 NMB（D） 结合。降低 USP21 可以增加 NMB（E） 中的泛素水平。进一步的机制研究显示，NMB 与 USP21 之间存在直接的物理相互作用，这一点通过共免疫沉淀测定法得到证实（图 7D）。重要的是，USP21 的耗竭导致 NMB 泛素化增加（见图 7E）。这些发现共同表明，CRC 中 NMB 表达升高与 USP21 介导的去泛素化机制相关。NMB 通过调控 NF-κB 信号通路影响 CRC为阐明 NMB 介导调控 CRC 的分子机制，作者进行了 GSEA 分析，比较低 NMB 表达组和高表达组的转录谱。分析显示，高 NMB 表型中 NF-κ B 信号通路显著富集，CRC 相关通路也显著富集，进一步支持 NMB 在 CRC 发病机制中的功能相关性（见图 8A）。NMB 通过调控 NF-κB 信号通路影响 CRC 的发展。GSEA 合并的富集图，包括富集得分和基因集（A）。 西部印迹显示敲低 NMB 可显著降低 S536 位点 p65 的磷酸化，总 p65 略有下降 （B）。 在细胞功能测试中，通过添加 TNF（NF-K-B 激活剂）可以逆转敲低 NMB 引起的抗肿瘤效应。包括克隆实验分析 （C）、CCK-8 检测分析 （D）、 伤口愈合实验分析 （E）、 迁移和入侵实验分析 （F）。*P<0.05;**P<0.01;P<0.001。为研究 NMB 是否通过 NF-κ B 途径调节发挥致癌作用，作者检查了 p65 在丝氨酸 536（S536）的磷酸化状态。NMB 敲低导致 p65 磷酸化显著减少，表明 NF-κB 活化受损（见图 8B）。利用 TNF-α——一种强效的 NF-κ B 通路激活剂的功能验证实验，表明通路刺激能够有效抑制 NMB 敲低引起的肿瘤细胞增殖、迁移和入侵（见图 8C-F）。此外，鉴于 RAS 和 RAF 原癌基因在 CRC 中的预后重要性（15），作者发现 NMB 抑制显著降低了 RAS 和 RAF 蛋白表达水平，暗示其在 RAS/RAF-MAPK 信号传导轴上可能起调控作用。通过共表达网络分析，作者确定了与 NMB 表达最密切相关的前 100 个基因（图 9A 、B）。随后采用皮尔逊相关分析评估这些基因 mRNA 表达水平与药物敏感性（IC50 值）之间的关系。结果显示，与 NMB 表达正相关的基因与 5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药性有显著关联。此外，NMB 共表达基因与多种化疗药物和靶向治疗（包括甲氨蝶呤、管巴他汀和沃立诺他他）具有显著相关性（见图 9C）。药物敏感性分析。通过关联组学（A） 鉴定了 CRC 队列中的 NMB 共表达基因。显示前 50 个基因与大肠癌 NMB 呈正负相关热图。红点，正相关基因;蓝点，负相关基因 （B）。NMB 共表达基因组与药物耐药性相关，红色表示正相关，基因表达越高，药物耐药性增加，蓝色表示相反。（C）。 总结 总之，作者对公共数据库和临床 CRC 病例的综合分析确认 NMB 是结直肠癌的重要预后生物标志物。通过体外研究，作者已证明 NMB 在 CRC 发病机制中的调控作用。为提升临床效用，作者开发了一种高度预测性的患者存活评估线。机制上，作者发现 USP21 介导的去泛素化会上调 CRC 中的 NMB 表达，进而调节 p65 磷酸化以激活 NF-κ B 信号通路，从而影响 CRC 的进展。
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