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使用 UPLC-Q-Exactive Plus 进行分析后，中药提取物在正离子和负离子模式下产生了两个不同的质谱文件。每种离子模式的质谱如图 1 所示。中药提取物中共鉴定出 637 种化合物，主要分为氨基酸及其衍生物、生物碱、类黄酮、萜烯、有机酸和糖类。在前 80 种化合物中，鉴定出 18 种潜在活性成分。SwissTargetPrediction 产生了 595 个人类靶标，其中 459 个与 UniProtKB/Swiss-Prot 中审查的 Gallus gallus 条目一致;随后将这些作为鸡支持的靶标进行分析。
图 1.中药总离子图。（一）正离子模式。（B）负离子模式。
对 GeneCards 数据库、OMIM 数据库和相关文献的全面搜索总共产生了 2706 个与 MS 感染相关的靶点。利用微生物信息云平台上的在线绘图工具，有助于识别多发性硬化症感染与中药化合物的生物活性成分之间的 147 个共同靶点，如图 2A 所示。
图 2.网络药理学分析。（A）中医和多发性硬化症感染共同靶点的维恩图。（B）核心目标网络。
从 String 数据库中检索交叉目标，将物种指定为“Gallus”，最小相互作用置信度阈值为 0.700。排除无相互作用的蛋白质，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。分析结果显示，118 个基因中 145 个节点和 442 个边缘，平均节点度为 6.1。将该数据导入 Cytoscape 3.9.1 进行可视化（图 S1），其中蓝色方块表示中药化合物的活性成分，红色圆圈表示作用靶点。利用 Cytoscape 3.9.1 和 R 语言 4.3.1 中的“Cyto NCA”插件根据特定标准识别核心靶点：学位：22;拉克：13.82;网络：15.06;特征向量：.15;接近度：.59;中间度：8.92。鉴定出 13 个核心靶点：VEGFA、CASP3、PIK3CB、SRC、JAK2、MMP9、PIK3R1、CDC42、PIK3CA、STAT3、PIK3CD、EGFR 和 KDR，如图 2B 所示。
使用 DAVID 数据库对交叉靶标进行基因本体（GO）富集分析，包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）。共鉴定出 136 个 BP、45 个 MF 和 28 个 CC。使用 R 4.3.1 版本选择并可视化每个类别中基于-log10（pvalue）的前十个条目，如图 3A 所示。分析表明，交叉靶点主要与 BP 类别中的磷酸化、信号转导和蛋白质磷酸化等过程相关;MF 类别中的 ATP 结合、金属离子结合和锌离子结合;以及细胞质、膜和细胞外基质等细胞成分的富集。此外，还对 KEGG 信号通路进行了富集分析，发现 32 条通路显着富集 （p < 0.05）。对前 10 种富集信号通路进行了目视检查，如图 3B 所示。结果突出了 VEGF 信号通路、ErbB 信号通路和 FoxO 信号通路等通路中交叉靶点的显着富集，这些通路以其在血管生成、细胞增殖、免疫炎症、细胞周期调节和细胞迁移中的关键作用而闻名。
图 3.中医相关交叉基因的 GO 和 KEGG 通路富集分析。（A）共同靶点的 GO 富集分析。（B）共同靶点的 KEGG 通路分析。
通过监测鸡的体重、精神和运动功能以及关节形态等各种参数来评估中药对 MS 感染的有效性。在整个实验过程中，对照组的体重持续增加，而模型组的体重增加率明显较低。模型组的体重增加在第 6 天停止，随后在研究的后期观察到体重下降。中医治疗可改善 MS 感染引起的体重减轻，其中中医 H 组效果最为明显。TCM-H 组的体重变化轨迹与 TYL 治疗的阳性对照组非常相似，如图 4A 所示。第 16 天各组鸡群的状况 所示。对照组每只鸡表现出积极的精神状态，积极进食，步态正常。相反，模型组的鸡表现出羽毛凌乱、嗜睡和多发性硬化症感染的典型症状，如跛行和卧位倾向。中医治疗有效缓解了 MS 感染引起的嗜睡和关节肿胀症状，其中中医 H 组效果最为良好，与 TYL 组鸡群的状态非常相似。根据预定义的评分表对每组进行临床症状评分，以评估中药对 MS 感染的疗效，如图 4B 所示。 TCM-M 组和 TCM-H 组均显著降低 MS 感染后的临床症状评分，TCM-H 组和 TYL 组评分无显著差异（p > 0.05）。这些结果凸显了中医治疗对 MS 感染引起的临床症状的显着改善。
图 4.中医有效缓解多发性硬化症感染鸡的症状。（A）中药治疗的 MS 感染鸡体重的影响。（b）中医对 MS 感染鸡临床症状评分的影响。（c）中医对 MS 感染鸡跗关节病变评分的影响。（D-H）中医对血清炎症因子水平的影响.##p < 0.01，与模型相比;*p < 0.05，**p < 0.01 与对照 （x ±s， n = 6）。
对各实验组的跗关节进行尸检检查。模型组表现出大量灰白色炎症性渗出物，部分形成黄色干酪状物质。中医-H 治疗可显著减轻炎性渗出液的产生。根据尸检结果对跗关节的评估根据中概述的标准进行评分，结果如图 4C 所示。在模型组中，大多数鸡的双跗关节关节肿胀，足垫肿胀和畸形，导致活动能力受损。值得注意的是，中医-M 组和中医-H 组跗关节尸检评分显著降低（p <0.01）。这些发现强调了中药对多发性硬化症感染引起的关节损伤的显着改善作用。
为了验证中药对跗关节的保护作用，作者评估了鸡跗关节的组织病理学改变（ 图 5）。对照组没有表现出明显的病理变化。相反，模型组在滑膜组织和关节腔内表现出广泛的炎症细胞浸润，导致弥漫性分布、滑膜组织增生和软骨损伤。此外，关节韧带组织表现出胶原纤维排列紊乱，伴有炎症细胞浸润和成纤维细胞增生。TYL 治疗显着减轻了关节病变，表现为炎症细胞浸润显着减少。软骨和关节韧带结构保持完整，滑膜增生明显改善。与模型组相比，中医对 MS 感染引起的关节病变具有缓解作用，显著减少炎症细胞浸润和滑膜增生。TCM-H 的疗效与 TYL 非常相似。
图 5.中药治疗 MS 感染鸡关节的组织病理学观察。（A）滑膜组织。（B） 关节韧带。（C）软骨组织。
多发性硬化症感染通过引起炎症细胞因子的过度释放来诱发鸡跗关节滑膜炎，从而导致滑膜损伤。本研究深入研究了中药对鸡血清中促炎和抗炎细胞因子水平的影响，如图 4 所示。ELISA 分析显示，与对照组相比，模型组血清中 TNF-α、IL-1β和 IL-6 水平显著升高（p < 0.01），IL-4 和 IL-10 水平降低（p < 0.01）。相反，所有测试的中药剂量均显着降低鸡血清中的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平 （p < 0.01），同时显着恢复 IL-4 和 IL-10 水平 （p < 0.01）。这些发现强调了中药在减弱多发性硬化症感染鸡血清中的促炎介质和恢复抗炎介质的强大能力。
为评估 MS 感染对代谢途径的影响，对对照组、模型组和中医组 3 组进行了血清非靶向代谢组学分析。通过使用总离子色谱（TIC）评估交集的 QC 样品，证实了方法学的稳健性，表现出优异的稳定性、可重复性和数据相关性图 S4。鉴定的代谢物主要包括脂质和脂质样分子（36.62%）、有机酸及其衍生物（21.56%）和有机杂环化合物（13.57%）图 S5。利用 OPLS-DA 模型，观察到对照组和模型组之间（ 图 6A）以及模型组和中医组之间（ 图 6B）之间存在明显的分离。这些发现表明，多发性硬化症感染会引起代谢物水平的显着改变，中医表现出通过调节代谢途径来对抗多发性硬化症感染的能力。
图 6.代谢组学分析。（A） OPLS-DA 模型对照组与模型的分数散点图。（B）OPLS-DA 模型组模型与中医的核心散点图。（C） 组控制与模型的火山图。（D） 模型组与中医组的火山图。（E） 对照 VS 模型的潜在代谢途径。（F） MOD 与 TCM 的潜在代谢途径。
共检测到 12,040 种正负离子模式下的特征物质，鉴定出 681 种代谢物。使用 p < 0.05 和 VIP > 1 的标准筛选组间差异代谢物。与对照组相比，模型组显示出 190 种差异代谢物，其中 57 种上调，133 种下调（ 图 6C）。10 种关键差异代谢物的。相比之下，中药组表现出 62 种差异代谢物，其中 27 种上调，35 种下调（ 图 6D）。10 种显著差异代谢物。中医治疗后，22 种受 MS 感染影响的代谢物出现明显逆转。值得注意的是，15 种代谢物（包括 L-乳酸、氧化肾上腺铁氧还蛋白、N-（2-呋酰）甘氨酸3-Hydroxyisovalerylcarnitine和5-Methoxy-5-oxopentanoic酸）的水平显着降低，而 7 种代谢物（如甘油酸、PI（20：3/18：1）、β-D-半乳糖和 N-乙酰组胺）的水平显着增加。
利用 KEGG 数据库分析不同代谢产物的相关代谢途径，对对照组、模型组和中医组的不同代谢产物进行富集分析。 图 6E 说明了基于通路影响值 （>0.1） 的筛选过程。在模型组中，共有 10 条代谢途径表现出显著富集，包括 D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、乙醛酸和二羧酸盐代谢、组氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨基酰基-tRNA 生物合成和色氨酸代谢。此外，乙醛酸盐和二羧酸盐代谢在中药治疗后也表现出显着的富集，如图 6F 所示。
中医因其调节肠道菌群的能力而受到认可，从而影响疾病的发病机制（Chen， et al.， 2024）。为了研究 MS 感染引起的肠道菌群的具体变化以及中药对该菌群的影响，作者对粪便样本进行了 16S rDNA 基因测序。测度微生物群落丰富度和多样性的α多样性分析显示，模型组的 chao1 和 ace 指数显著降低（p <0.01），表明公鸡盲肠微生物群的丰富度和多样性下降表 S8。用于比较各组微生物群落结构的β多样性分析显示，三组之间的肠道微生物群组成存在显着差异（ 图 7A 和图 7B）。这些发现表明，MS 感染显著改变了鸡的盲肠微生物群，而中药治疗改善了盲肠微生物生态系统。
图 7.微生物群落组成的 PCA 分析和 PCOA 分析。（A）多样品 PCA 分析。（B）多样本 PCOA 分析。
MS 感染导致厚壁菌门丰度显著下降，而弯曲杆菌门和梭杆菌门丰度显著增加（ 图 8A）。相反，中医治疗有效逆转了 MS 感染引起的门结构变化，显著增加了厚壁菌门的丰度。同样，MS 感染降低了厚壁菌门与拟杆菌门（F/B）的比率，而中药治疗则增加了厚壁菌门与拟杆菌门（F/B）的比率（ 图 S6）。在属水平（ 图 8B），MS 感染显著增加了弯曲杆菌和梭杆菌的丰度，同时降低了粪杆菌、梭状芽孢杆菌和 Lachnospiraceae_unclassified 的丰度。中药治疗不仅降低了弯曲杆菌和梭杆菌的丰度，而且显著提高了粪杆菌、梭状芽孢杆菌和丁球菌的丰度。
图 8.肠道微生物成分分析。（D）门水平上肠道微生物群的相对丰度。（E）属水平上肠道微生物群的相对丰度。
进一步研究中药对鸡盲肠菌群的调控作用，采用 LEfSe 分析结合线性判别分析（LDA）法，鉴定出群体间差异和优势类群。分析结果显示，优势类群共有 45 个物种（LDA≥2.5），其中对照组 22 个，模型组 10 个，中药组 13 个。对照组的特征是未分类的 Lachnospiraceae、Burkholderiales、Sutterellaceae、Parasutterella 和 Ruminococcus 的比例相对较高。在模型组中，坎皮洛巴菌门、鸡杆菌属和巴氏杆菌科的丰度增加。中药组主要由厚壁菌门、RF39_g_norank 和乳腺菌属（ 图 9 和 S8）组成。
中药抑制JAK2-STAT3 和 PI3K-AKT 信号通路
JAK2-STAT3 信号通路是一种特征明确的细胞内信号转导途径，影响细胞增殖、分化、细胞凋亡和炎症反应，在各种疾病中起着至关重要的作用。在网络药理学预测的指导下，作者评估了 JAK2、p-JAK2、STAT3 和 p-STAT3 的表达。作者的研究结果表明，与对照组相比，MS 感染显着提高了滑膜组织中 Jak2 和 Stat3 蛋白的磷酸化 （p < 0.01）。用中药化合物处理有效减少了这种磷酸化（p < 0.01）。此外，该化合物显着提高了 PIAS3 和 SOCS1 蛋白的表达水平（ 图 10）。
图 10.TCM 抑制 JAK2-STAT3 通路。（A）以 GAPDH 为上样对照，Western blot 检测 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、PIAS3 和 SOCS1 蛋白表达水平。（B）JAK2 和 p-JAK2 的蛋白表达水平。（C）STAT3 和 p-STAT3 的蛋白表达水平。（D）PIAS3 的蛋白表达水平。（E）SOCS1 的蛋白表达水平。所有结果均显示为平均值±标准差。##p < 0.01，与模型相比;*p < 0.05，**p < 0.01 与对照。
与 SRC 类似，PIK3CA 是中医预防和治疗 MS 感染的重要靶点。作者评估了 PIK3CA、p-PI3K、AKT、p-AKT 和 SRC 的表达水平。MS 感染显著增强滑膜组织中 PI3K 和 AKT 蛋白的磷酸化（p < 0.01），SRC 蛋白表达升高（p < 0.01）。与模型组相比，中药治疗显着抑制了 PI3K 和 AKT 磷酸化，降低了 SRC 蛋白的表达（ 图 11）。
图 11.TCM 抑制 PI3K-AKT 通路。（A）以 GAPDH 为上样对照，Western blot 检测 PI3KCA、p-PI3K、AKT、p-AKT 和 SRC 蛋白表达水平。（B）PI3KCA 和 p-PI3K 的蛋白表达水平。（C）AKT 和 p-AKT 的蛋白表达水平。（D）SRC 的蛋白表达水平。所有结果均显示为平均值±标准差。##p < 0.01，与模型相比;*p < 0.05，**p < 0.01 与对照组。
总结
本研究介绍了一种针对多发性硬化症感染的新型中药复方混合物，即中药。使用 MS 感染模型，作者证明了该化合物在改善 MS 诱导的症状方面的显着功效。利用网络药理学、代谢组学和 16S rDNA 测序，作者探索了中药化合物在 MS 挑战下的活性成分和改善作用的机制。作者的研究结果表明，该化合物通过调节 JAK2-STAT3 和 PI3K-AKT 信号通路来抑制炎症因子释放并减轻跗关节损伤。代谢组学分析表明，MS 感染会破坏氨基酸和能量代谢，乙醛酸和二羧酸代谢被认为是中药化合物对抗 MS 的关键途径。此外，该化合物还改善了 MS 引起的肠道微生物群失衡。这些结果阐明了中药对 MS 感染的有效成分和机制，为中药在治疗和症状管理中的临床应用提供了基础。同时，作者强调，虽然中药治疗可以缓解症状，但未来需要结合病原体定量和纯中药对照的研究，以更好地描述治疗效果与预防效果。
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