4+铜死亡+甲基化+预后+分型+实验，搭配热点的分型结合预后的简易思路!！

导语

结果：

遗传突变分析

突变分析中发现所有十个蜂根菌基因均有不同程度的突变。CDKN2A 的突变频率最高，共有 18 名患者出现突变（图 1A）。值得注意的是，CDKN2A 突变主要位于该基因的结构域（图 1B）。对蜂巢菌相关基因进行了共表达/互惠分析，显示出包括 LIAS 和 DLAT 在内的多种突变共存（图 1C）。作者分析了每个卵管菌突变与胃癌预后之间的关系。分析后，作者发现单个基因的突变与胃癌预后之间无关联。此外，通过根据所有基因是否突变分类，观察到整体卵管变基因突变与胃癌预后之间的关系。分析后发现基因突变预后影响胃癌的总体生存期（图 1D 和图 1E）。在分析有无乳腺癌总体突变与传统临床参数关系时，作者的分析显示总体突变与年龄、MSI 和 TCGA 亚型相关。

胃癌中铜死相关基因的基因组变化。胃癌中铜死亡相关基因的基因组变化。CDKN2A 在胃癌中拥有最多的突变位点，其次是 DLAT 基因。B：CDKN2A 中的特异性基因突变位点。在基因的线性结构中，每个棒棒糖图都是一个特定的突变位点。图越高，代表人数越多。C 与铜诱导细胞死亡相关的多个基因突变有可能共出现。D 铜死亡基因的突变可能导致更好的肿瘤预后。E 基因突变状态与肿瘤无进展生存期（PFS）预后之间的关系。F 铜死亡基因突变的存在在不同肿瘤表型中有所不同，MSI-H 肿瘤和老年人的发生率较高，而 EBV 感染肿瘤亚型则未观察到突变

拷贝编号分析

作者的结果显示，胃癌中铜管复制基因的拷贝数发生差异性变化。DLD 主要与拷贝数增加相关，而 LIAS 主要与拷贝数减少相关（图 2A. 只有 PDHB 拷贝数改变与预后相关，在分析拷贝数变异和胃癌预后时，拷贝数增加与肿瘤预后改善相关（图 2B）。本研究旨在探讨 PDHB 拷贝数变异对胃癌预后可能的影响。为此，作者考察了 PDHB 变化与胃癌 MSI 评分之间的相关性，这些分数来自 cBioPortalData。作者的发现表明，PDHB 水平与胃癌中 MSI 评分呈正相关（附加文件 2：图 S1）。在分析 CUPROPTOS 基因拷贝数改变与临床表型关系时，大多数铜管虫基因拷贝数变异与 MSI 相关（图 2C）。此外，MTF1 也与肿瘤基因分型相关（图 2D）。

与铜诱导细胞死亡相关的基因拷贝数变化会影响肿瘤特征的变化。A 铜管变革的拷贝数变更频率，其中红色代表拷贝数增益，蓝色表示拷贝数损失，绿色表示拷贝数无变化。B PDHB 基因拷贝数改变影响胃癌的预后。C PDHA1 和 DLAT 基因的拷贝数改变与胃癌 MSI 之间的关系。D MTF1 基因拷贝数改变影响胃癌和 MSI 亚型的分类

甲基化分析

在甲基化分析中，通过差异性甲基化分析发现四个甲基化位点在胃癌中表达较高，有趣的是，所有这些甲基化位点均位于 CDKN2A 中（图。3A）。在启动子区域筛查甲基化位点后，该区域有九个基因表现出甲基化。只有 PDHA1 没有甲基化位点。根据预后分析，共有五个甲基化基因影响了胃癌的预后。这五个基因均高甲基化，预后较差。LIAS 中的五个碱基属于 LA 复合体，而其他四个基因（CDKN2A、DLAT、GLS 和 MTF1）属于 PDX 复合体。其中，CDKN2A 甲基化与胃癌的肿瘤发生和预后相关（图 3B 至 F）。在作者对临床参数的分析中，CDKN2A 与多个临床参数相关，包括年龄、MSI 和 TCGA 基因分型（见图 3）。3G–I）。

与铜诱导细胞死亡相关基因的 DNA 甲基化变化会影响肿瘤特性的变化。CDNK2A 基因的 DNA 甲基化会增加胃癌的发生。B–F 生存曲线显示了卵管切除基因对胃癌预后的影响。G–I 卵管病基因对胃癌临床特征（年龄、MSI 及病理分类）的影响

可变拼接分析

外显子跳跃是所有基因中唯一发生的变体剪接类型，也是所有变体剪接事件中最常见的变体剪接类型（见图。4A）LIAD 中所有可变剪接事件均为外显子跳跃。相反，CDKN2A 具有多个变量剪接事件。对变异剪接事件的预后分析显示，有五个基因对预后有影响，并且与变异剪接事件相关。其中，CDKN2A 中 ES 的增加与患者生存期的增加相关（见图 4B），而 GLS 中 AT 的增加与生存率的提升相关（见图 4C）。此外，LIPT1 基因中的多重外显子跳跃导致了不同的预后效应（图 4D）。临床参数与预后变量剪接事件相关。研究发现，LIPT1 和 GIS 基因的斑驳几乎普遍与胃癌的临床参数相关。其中，GIS 的剪接方式不同，AT 剪接事件越多，T 期的强度也越高（见图 4E）。在 MSI 分期系统中，LIPT1 的外显子跳跃在 MSS 分期系统和混合分期系统中表现得更为明显（见图 4F）。

与铜诱导细胞死亡相关基因的 DNA 甲基化变化会影响肿瘤特性的变化。CDNK2A 基因的 DNA 甲基化会增加胃癌的发生。B–F 生存曲线显示了卵管切除基因对胃癌预后的影响。G–I 卵管病基因对胃癌临床特征（年龄、MSI 及病理分类）的影响可变拼接分析

管状菌丝基因中替代剪接变化的特征。论：铜管菌属基因中不同类型的替代剪接。图中不同的颜色代表不同的可变剪切类型。B-D 铜死亡基因可进行替代剪接，从而提高患者生存率。C-F 卵管切除术替代性剪接对肿瘤临床特征的影响（MSI 和病理分类）。G 替代性接合变更能改善胃癌患者的肿瘤预后。H-I。APA 在卵巢形成与临床特征中的关系

在胃癌 APA 基因检测中，10 个蜂根生病基因中有 9 个显示 APA 改变（除 MTF1 外）。此外，长期 APA 与胃癌预后较差相关（见图。4G）。作者进一步分析了 APA 与临床参与的关系，发现与预后相关的 DLAT 与 T 阶段、分期分类和 MSI 阶段相关（见图 4H）。作者还发现 G LS、FDX1 和 DLD 与之前 TCGA 基因分型中的分期有关。这三者在 CIN 亚组（F、i、g. 4、I）中均较高。

基因表达分析

TCGA 数据库被用于对 10 个基因进行差异表达分析。结果显示，三个基因（CDKN2A、DLAT 和 GLS）在胃癌中表现出差异表达（见图）。5A）GSE13911 是一个表达谱微阵列，包含 38 个癌症基因与 31 个正常基因。利用 GSE13911 进行的差异表达分析显示，只有 GLS 在胃癌中表达较高（见图 5B）。利用 TCGA 对蜂根菌的预后分析显示，十个蜂根菌基因中有五个与预后相关（LIPT1、DLD、PDHA1、PDHB 和 MTF1）。分析后发现共有五个基因影响胃癌预后（LIPT1、DLD、PDHA1、PDHB 和 MTF1）。交叉分析显示，两组数据集中共有三个基因影响胃癌预后（PDHA1、PDHB 和 MTF1）（图 5C）。其中，PDHB 和 MTF1 的表达对胃癌具有保护作用，而 PDHA1 则存在风险。为了更深入理解铜死亡基因与胃癌临床表型之间的相关性，包括 TNM 分期、MSI 分期和基因表达分期，作者分析了不同表型间的基因表达差异。作者的发现显示，CIN 亚型表现出高表达水平的 CDKN2A 和 GLS 基因（图 5D），而肠道亚型则表现出高表达水平的 PDHB 和 PDHA1 基因（见图 5E）。此外，作者对 MSI 亚型的分析还揭示了这两个基因与 MSI 亚型之间的联系（见图 5F）。

胃癌中铜管起作用的 mRNA 表达特征。答：多个铜死亡相关基因在胃癌中表达差异，且在癌症中升高。B GSE13911 中管状变异的差异表达。C 维恩图展示了 Cuproptosis 对预后基因在 TCGA 和 GSE62254 数据集中的影响。D–F 卵巢病基因对胃癌临床特征的影响

铜管菌基因表达调控与功能分析

在 DNA 突变调控铜管变的分析中，作者鉴定出八个带有突变的基因。作者进一步分析了这八个基因对促卵菌病基因表达的影响。作者发现，只有 CDKN2A 突变影响基因表达，且突变基因表现出较高的表达水平（见图）。6 甲基化分析中，作者共识别出两个接受甲基化调控的基因（FDX1 和 CDKN2A）（图 6B-6E），其中 CDKN2A 具有三个与表达相关的甲基化位点。基因组区的一个甲基化位点与表达呈正相关，而第一个外显子区的两个甲基化位点与表达呈负相关。在转录调控预测中，作者发现共有 46 个转录因子参与了铜管生病基因的调控。其中，MTF1 与 21 个转录因子相关（见图 6F）。关于转录因子，CTCF（CCCTC 结合因子）与八个铜管生病基因相关，YY1 与六个基因相关。在 ceRNA 调控网络中，有六个基因被 miRNA 调控，这些 miRNA 主要与 13 个 miRNA 相关（见图 6G）。对与这些 miRNA 相互作用的 LncRNA 进一步分析显示，has-miR-5047 与 35 个 lncRNA 相关。

核心根茎生菌基因表达调控的预测。CDKN2A 基因突变会影响基因表达。B–E 基因甲基化影响基因本身的表达。F 转录因子调控铜管变异表达的预测。G-15 miRNA 在整个 ceRNA 调控网络中起着关键作用

基于之前的分析，作者发现共有四个基因与胃癌相关（其中一个与胃癌发生相关，三个与胃癌预后相关）。因此，这四个基因被选中进行功能分析。首先，作者利用 BIOGRID 数据库预测了这四个基因的相互作用蛋白。此外，作者通过 Go 分析和 KEGG 通路分析观察了与胃癌相关的前乳腺菌转基因的可能功能，发现 GO-BP 分析中的相互作用蛋白主要与“线粒体基因表达/线粒体翻译”相关（见图）。7 在 KEGG 通路富集中，相互作用蛋白主要与细胞周期相关（图 7B）。基于单基因 GSEA 分析，作者考察了这四个基因与肿瘤相关通路之间的关系。分析后，作者发现这四个基因分别与 22 至 48 条通路相关。其中共有 21 条通路与四个基因共同。这些通路包括与糖酵解和脂肪酸代谢相关的通路（见图 7C）。最后，作者分析了蜂根菌基因与免疫细胞及免疫检查点之间的关系。分析显示，这四个基因与大多数免疫细胞无关，仅与 T 辅助细胞相关。在免疫检查点分析中，MTF1 与多个免疫检查点相关，其他三个基因与免疫检查点相关性不佳。

铜管生病核心基因的功能预测。参与铜管菌变的核心基因的 Go 分析气泡图。参与铜管变形的核心基因 KEGG 通路分析的B 条形图。C 四个基因对影响代谢信号通路（如糖酵解和脂肪酸代谢）至关重要。D 虫舌菌与免疫细胞之间的关系。图中较红色代表基因与免疫细胞之间的正相关，较蓝的颜色表示基因与免疫细胞之间的负相关

铜死胃癌的多组学预后模型与功能分析

基于上述多组学分析，作者发现与卵管切除症相关的基因影响不同组织学中胃癌的预后。基于该分析，作者使用影响胃癌预后的多组学数据（PDHB 基因拷贝数变化、CDKN2A、DLAT、GLS、MTF1 和 LIAS 的甲基化变化，五个基因的替代剪接数据，DLAT APA 变化数据，LIPT1、DLD、PDHA1、PDHB 和 MTF1 的基因表达数据），构建了多组学预后模型。本研究利用无监督聚类法开发了胃癌的预后模型。作者发现，当亚型数量的平均统计量最高为 2 时，效果最佳（见图。8A），基于 CPI 分析结果和差异统计数据。随后，为了使分类更稳健，作者使用十种聚类技术将患者分为第 1 组（CS1）和第 2 组（CS2），通过共识聚类进行验证（见图 8B）。共识群组样本的相似性也通过等高线分析评估，CS1 的等高线得分为 0.51，CS2 为 0.31。因此，这两个聚类结果明显不同（图 8C）。在构建多组学模型上进行预后分析时，发现该模型与肿瘤的四个预后指标均相关（图 8D-F）。多组学模型主要与年龄和微卫星不稳定性（MSI）（见图 8G）相关，进一步分析模型与临床参数的关系显示，多组学模型主要与年龄和 MSI 相关。

构建多组学模型。《针织体多组学模型分类选集》。模型在开始下降时聚集效果最佳，因此会选出两组。B Cuproptosis 多组学模型的可视化相关热图。C–F 多组学模型对胃癌预后的影响。G 多组学预后模型与临床参数之间的关系

最后，作者最近分析了模型与肿瘤相关通路之间的关系，以理解预后模型的具体功能。分析显示，预后模型与 TP53 信号通路、IL2 信号通路和 IL6 信号通路相关（图）。9 答）作者分析了预后模型与免疫细胞及免疫检查之间的关系。作者发现预后模型与 Th17、Th2 和 Th1 细胞相关（图 9B），以及包括 CD86、CD80 和 CD40 在内的免疫检查点（图 9C）。

多组学预后模型的功能预测。肿瘤相关通路在 CS2 模型中均为升高。B CS2 分型会触发免疫细胞的激活。C 多组学预后模型与免疫检查点之间的关系

核心基因 MTF1 影响胃癌的生物功能

在构建多组学模型时，发现 MTF1 会影响多种组学中 STAD 的预后。此外，MTF1 在模型中每个变量的重要性评分中排名第一。为了更深入地理解 MTF1 基因对该疾病的影响，作者进行了涉及 MTF1 在胃癌细胞系（MGC803）中过度表达的实验，以评估其对胃癌生物学特性的影响（见图）。10A）作者的初步研究聚焦于 MTF1 对细胞凋亡的影响，结果显示 MTF1 的过度表达有效减少了胃癌细胞中的凋亡（见图 10B）。此外，作者还观察到了 MTF1 对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。如图 10C 所示，MTF1 增强了肿瘤细胞的侵入。为确保结果的可靠性，作者使用了不同的胃癌细胞系（HGC-27）进行实验，结果与 MGC803 的结果一致（见附加文件 3：图 S2）。

MTF1 影响胃癌的凋亡、侵袭和迁移。MTF1 基因过度表达的 WB 图。B MTF1 基因的过度表达会导致肿瘤细胞系中的凋亡减少。C MTF1 基因过度表达导致肿瘤细胞侵袭增加。

总结

总之，本研究全面分析了与卵舌菌相关基因的特征以及 STAD 中的分子变异。首次基于九个与卵巢炎相关基因构建的预后风险评分，将患者分为两组。CS1 组患者明显表现出较短的 OS、DFI、DSS 和 PFI，同时免疫浸润水平和免疫检查点表达显著更高，预测对 ICI 反应更佳。作者的研究结果还将为基于蜂巢病及蜂巢病相关基因的 STAD 新治疗策略提供见解。