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DEG 鉴定与功能富集分析 作者通过 Limma 程序识别了训练集中 367 个 DEGs，其中 120 个上调，247 个下调（ 见图 1A）。热图显示了前 50 基因的上调和下调表达（ 见图 1B）。为探究这些基因的主要功能，作者进行了 DO 和 KEGG 富集分析，结果显示 DEG 主要与肿瘤相关，包括胆道癌、肾细胞癌和良性器官系统肿瘤（ 见图 2A）。在功能方面，DEGs 主要参与肿瘤相关的代谢和进展途径，例如药物代谢-细胞色素 P450、细胞周期、p53 信号通路、ECM-受体相互作用以及花生四烯酸代谢（ 见图 2B）。基于 DEG 的富集分析可能会丢失非差异基因对表型的大部分信息。因此，作者进行了 GSEA 以验证浓集分析结果。如图 2C，D 所示，肿瘤代谢相关通路的下调，以及细胞循环、DNA 复制和核糖体过程的增加，与 KEGG 结果一致。差异基因筛查。（A）火山图与（B）训练队列中 HCC 样本中与正常对照组基因表达差异的热图。红色：上调表达;绿色：表达量下调。差异基因的富集分析结果。（A）DO 和（B）KEGG 富集分析的泡泡图。对 HCC 中（C）上调和（D）下调通路相关基因集的富集分析结果。鉴定 ECM1、NPC1L1、RSPO3 作为 HCC 的诊断生物标志物作者采用随机森林方法和最小绝对收缩与选择算子模型筛选关键生物标志物以供诊断用途。共筛查了 367 个差异基因，涵盖 14 个核心诊断基因和 33 个核心诊断基因（见图 3A，B）。作者选择了三个交集基因 ECM1、NPC1L1 和 RSPO3 作为后续分析的候选生物标志物（见图 3C）。验证队列中三种候选基因均表现差异，ECM1、NPC1L1 和 RSPO3 在肿瘤中显著下调（p < 0.05;图 4A–C）。为进一步确定三个核心基因的表达，作者采集了 HCC 患者及临床对应的副癌组织样本进行 qPCR 检测，进一步证实 ECM1、NPC1L1 和 RSPO3 在 HCC 中显著下调（p < 0.05;图 4D–F）。用于肝细胞癌诊断的遗传生物标志物鉴定。（A）通过 LASSO 分析鉴定出 14 个λ值最小的基因。上方水平坐标表示对应不同 λ 值的建模基因数量。（b） 随机森林算法特征选择图。（C） 同一生物标志物的维恩图，通过 LASSO 和随机森林算法筛选。验证队列中三个核心诊断基因表达发生改变，包括（A）ECM1、（B）NPC1L1 和（C）RSPO3。qPCR 分析显示，HCC 组中（D）ECM1、（E）NPC1L1 和（F）RSPO3 显著下调，相较于副癌组织。为了确定候选标记的诊断效度，作者必须在培训和测试队列中共同验证它们。通过绘制 ROC 曲线和评估 AUC 值，确定 ECM1、NPC1L1 和 RSPO3 的诊断表现。训练队列中 ECM1、NPC1L1 和 RSPO3 的 AUC 值分别为 0.994、0.782 和 0.992（见图 5A–C），表明这三种候选标志均为 HCC 发展的良好诊断者。在测试队列中，三种候选标记的 AUC 值均为 1（见图 5D–F），表明其诊断表现具有普遍性。诊断性能验证。训练队列中三个核心诊断基因的 ROC 曲线，包括（A）ECM1、（B）NPC1L1 和（C）RSPO3。检测队列中三个核心诊断基因的 ROC 曲线，包括（D）ECM1，（E）NPC1L1 和（F）RSPO3。肝细胞癌中的免疫细胞浸润及其与 ECM1、NPC1L1、RSPO3 的相关性通过应用 CIBERSORT，作者首先检查了肝细胞癌和正常肝组织中免疫细胞的构成。如图 6A 所示，肝细胞癌中 Tregs、巨噬细胞 M0 和巨噬细胞 M1 的比例始终高于正常组织，而肝细胞癌中单核细胞、巨噬细胞 M2 和中性粒细胞的数量减少（p < 0.05）。图 6B 展示了免疫细胞之间的关系，显示 CD8 + T 细胞与 CD4 记忆静息细胞之间存在强负相关（R = −0.65），而 CD4 记忆激活细胞与 T 细胞γδ之间存在显著正相关（R = 0.68）。此外，巨噬细胞 M2 表达与 M1 和 M0 的表达呈负相关（R < −0.2）。Spearman 相关分析进一步分析了免疫细胞与诊断基因的关联，发现 ECM1 与巨噬细胞 M2 呈高度正相关（见图 7B;R = 0.45）和中性粒细胞，并且与 Tregs 和巨噬细胞 M0 呈高度负相关（图 7A，C;R = −0.38;所有 p < 0.001）。NPC1L1 与肥大细胞激活的正相关性最大（图 7E;R = 0.23），与肥大细胞抑制的负相关性最大（图 7D，F;R = −0.24;全部 p < 0.05）。RSPO3 与浆细胞呈正相关（见图 7H;R = 0.32）和中性粒细胞，而它与 Tregs 呈负相关（图 7G，I;R = −0.48;所有 p < 0.001）。总之，这些结果表明，这三个新识别的诊断基因与肝细胞癌中的免疫浸润有关。HCC 患者免疫细胞浸润分析。（A）比较 22 个正常组织中免疫细胞的表达水平，以及 HCC 患者癌细胞样本中的表达水平。蓝色和红色分别代表健康的对照（Con）和 HCC 样本。（B）22 个免疫细胞亚型的相关矩阵。红色表示正相关，蓝色表示负相关。对三个诊断基因和免疫细胞进行相关分析。（A）ECM1 表达与 HCC 中免疫细胞的相关性 Lollipop 图，以及与（B）巨噬细胞 M2 和（C）巨噬细胞 M0 的相关图。（D）NPC1L1 表达与 HCC 中免疫细胞的相关性 Lollipop 图，以及与（E）肥大细胞激活和（F）肥大细胞抑制的相关图。（G）RSPO3 表达与肝细胞癌免疫细胞的相关性 Lollipop 图，以及与（H）血浆和（I）Tregs 的相关图。生物标志物基因 RSPO3-si 在 HCC 中的表达与存活能力使用 qRT-PCR 评估了 RSPO3 在肝炎 B 和 SMMC7721 细胞中的表达。结果显示，三种 RSPO3-si 在两个 HCC 细胞系中均显著低于对照组（见图 8A）。对于肝炎 3B 细胞系，后续实验中选择了 RSPO3-si1 和 RSPO3-si2。对于 SMMC7721 细胞系，选择了 RSPO3-si1 和 RSPO3-si3 进行后续功能实验。随后，作者确认敲低 RSPO3 抑制了肝炎 3B 和 SMMC7721 细胞的增殖（见图 8B，C）。作者确认，敲低 RSPO3 促进了肝炎 3B（见图 8D–G）和 SMMC7721 细胞（见图 8H–K）中的凋亡。两种 HCC 细胞系中 RSPO3-si 的表达与功能验证。（A）肝炎 3B 型及 SMMC7721 细胞系中 RSPO3-si 的敲低效率。（B，C）RSPO3-si 对肝炎 B 和 SMMC7721 细胞通过 CCK8 的影响。（D–G）检测肝炎 3B 细胞中 RSPO3-si 的凋亡速率。（H–K）检测 SMMC7721 细胞中 RSPO3-si 的凋亡速率。作者确认了 RSPO3 在体外的效果。此外，还检测 RSPO3 敲低是否能增强小鼠巨噬细胞的抗肿瘤活性。结果显示，sh-RSPO3 小鼠的皮下肿瘤比对照组小（见图 9A–C）。为确定 sh-RSPO3 是否对皮下巨噬细胞有极化效应，作者检测了含有 CD138 的浆细胞、iNOS 检测的 M1 巨噬细胞和 CD206 的 M2 巨噬细胞（见图 9D）。研究显示，RSPO3 的敲低与减少的浆细胞、M2 亚型巨噬细胞相关，而在小鼠模型中则与 M1 亚型巨噬细胞增加相关。这些结果表明，RSPO3 与浆细胞、M2 巨噬细胞的浸润呈正相关，与 M1 巨噬细胞的浸润呈负相关。小鼠感染 SH-RSPO3。（A，B）sh-RSPO3 组和对照组的肿瘤体积。（C） sh-RSPO3 组和对照组肿瘤的权重。（D） sh-RSPO3 组和对照组中的 RSPO3、CD138、CD206 及 iNOS 表达。总之，作者利用机器学习识别并验证了三种可能有助于早期肿瘤筛查的诊断标志物。此外，RSPO3 的促致癌参与及其对浆细胞比例的潜在调控作用和巨噬细胞极化诱导也得到了验证。
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