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01 前言

神经系统主要由神经元构成，神经元与神经元之间通过突触进行连接，由此构成庞大的神经网络。包括学习和记忆在内的大脑复杂行为依赖于神经元集群的放电活动，神经元振荡（Neuronal Oscillations）指神经元或神经元群体在特定频率范围内有规律地、周期性地变化的电活动，可通过细胞外电场、局部场电位或脑电图等方式记录，例如α(8-12 Hz)、β (12-30 Hz)和γ(30-70 Hz)节律。低频慢振荡(Infra-slow oscillations,ISO，＜0.1 Hz)是大脑活动的重要节律。记忆巩固指大脑将短期记忆转化为长期记忆的过程，慢波睡眠（NREM）是记忆巩固的关键时期，在慢波睡眠期间，大脑的神经元活动高度同步化，形成利于记忆巩固的环境。海马是情景记忆形成的关键脑区，包括空间记忆。cAMP途径在海马依赖的记忆过程中发挥关键作用。cAMP是细胞内第二信使分子，能够将细胞外的信号如神经递质、激素等传递到细胞内，实现细胞内信号的调节，进而驱动突触可塑性和记忆形成导致神经网络的持久变化。神经元电活动在学习和记忆过程中得到了广泛的研究，但潜在的细胞内信号分子的实时动态的信息却知之甚少。

本研究使用最近开发的基因编码的cAMP传感器，在对记忆形成有重要影响的多个脑区中检测学习期间和学习后睡眠期间记忆巩固过程中的实时cAMP水平动态，揭示了不同睡眠-觉醒状态下cAMP信号和神经活动之间不同的时间协调性，证实慢波睡眠期间，海马依赖性记忆巩固发生在高 cAMP 活性的特定时间窗口内。具体如下：

• 慢波睡眠中，小鼠的 cAMP 水平与神经活动呈负相关，并表现出去甲肾上腺素 β1 受体依赖性的低频慢振荡（ISO），这些振荡在海马体和皮层之间同步

• 在 cAMP 峰值水平的狭窄时间窗口内，海马-皮质相互作用增加，在此窗口期间特定地抑制海马活动会损害空间记忆巩固

02 主要内容

为了表征学习过程中的cAMP信号动态变化及其与神经活动的关系，研究人员首先检测了小鼠海马中的cAMP水平。采用光纤光度计记录来自绿色荧光cAMP指示剂(GFlamp)的荧光信号实时报告细胞内cAMP水平的变化。通过立体定位注射腺相关病毒(AAV-hSyn-GFlamp) 在海马CA1区表达GFlamp，对侧CA1区注射AAV-hSyn-GCaMP，使用Ca²⁺指示剂GCaMP6测量神经活动(图1A-B )，这种”双侧双探头”的设计能够同时监测来自同一脑区的两个传感器的信号。进行如图1A所示的空间探索任务，结果显示，cAMP和GCaMP信号均表现出与小鼠运动相关的活动，当小鼠移动时，两种信号均增加，而小鼠静止时，两种信号均减少(图1C )，其中cAMP信号显示出比GCaMP信号更少的快速瞬变 (图1C-D)，两个信号之间存在显著的正相关关系（图1E）。值得注意的是，随着小鼠对物体的探索，cAMP和GCaMP信号都迅速增加（图1C,F-G）。

为了进一步阐明学习过程中的cAMP信号动态变化情况，研究人员测量了小鼠学习将听觉刺激与轻微足底电击联系起来的非空间记忆任务- -听觉恐惧条件反射( AFC )中的cAMP水平(图S1A )，这一过程依赖于基底外侧杏仁核( BLA )中的cAMP通路，所得结果与海马类似，即BLA的cAMP信号比GCaMP信号表现出更少的快速瞬变(图S1D )。以上结果表明，cAMP信号与行为过程中的神经活动密切相关。学习相关的刺激所诱发的显著的cAMP反应与cAMP依赖机制在记忆形成过程中的关键作用相一致。

Fig1.学习过程中快速cAMP水平的动态变化

研究人员进一步研究了睡眠期间记忆巩固关键脑区—海马中cAMP信号在睡眠-觉醒周期中的动态变化(图2A-B)。首先是cAMP信号和GCaMP信号的差异。结果显示，NREM睡眠中，cAMP信号远低于觉醒状态，但GCaMP活性仅有轻微下降；REM睡眠中，cAMP信号达到最低水平，与此睡眠阶段达到峰值的GCaMP信号形成鲜明对比(图2B-C)。此外，在不同睡眠-觉醒状态之间的转换过程中，cAMP和GCaMP信号均表现出快速的变化(图2B,2D)。值得注意的是，REM睡眠期间最低的cAMP水平与之前的报道的“通过酶免疫测定法测得的cAMP水平较高”这一结果相反。这种差异可能来自于体内和体外制剂之间的差异。此外，这两个信号在每个睡眠-觉醒状态中也表现出协调的动态。具体来说，觉醒期间，两种信号之间存在正相关关系，但在REM和NREM睡眠期间，这种关系转变为负相关（图2E-F）。

一个特别有趣的现象是，NREM期间，cAMP信号中存在一个显著的ISO，周期约为60s(图2G-I)。在小鼠学习后睡眠过程中也观察到了这种振荡，(图S2A-B)，提示ISO可能是NREM睡眠的内在特征。采用功率谱密度分析也揭示了GCaMP信号中的ISO类似于先前报道的海马网络在超慢节律(0.025 Hz)下的周期性兴奋性变化。但原始GCaMP信号中的ISO不太明显，可能是由于存在更频繁的快速瞬变，掩盖了低频振荡。cAMP信号中的ISO与脑电图(EEG)慢波活动(SWA)不相关，但与包括θ、σ和β波段的高频EEG功率呈负相关(图2J)。此外，海马纹状体在cAMP信号峰值处出现频率增加，并且在整个下降阶段均匀分布。相反，EEG纺锤波主要出现在下降相的后半段，即cAMP水平较低的(图2K-L,S2D)，提示cAMP水平的节律性波动与与记忆加工相关的一些电生理事件明显相关。cAMP信号与记忆相关电生理特征之间的特定时间关联为睡眠依赖记忆过程的细胞内和网络水平机制提供了新的见解，并提示了cAMP振荡在睡眠期间记忆巩固过程中的潜在作用，提示睡眠-觉醒周期中cAMP水平和神经活动之间的复杂关系。

Fig2. 睡眠-觉醒周期中cAMP水平的动态变化

睡眠过程中海马-皮层对话在记忆巩固中也起着关键作用，研究人员检测了海马-皮层网络中其他区域的cAMP信号动态。从多个区域同时测量cAMP信号，包括CA3区，内侧前额叶皮质(the medial prefrontal cortex,mPFC)和大脑后压部皮层（retrosplenial cortex,RSP)以及CA1区。选择两个皮层脑区是因为它们与海马介导的记忆过程密切相关，它们也是两个不同皮层网络中的代表性结构。结果显示，来自CA3、mPFC和RSP的cAMP信号与CA1的cAMP信号高度同步(图3A-I)。这种同步性在NREM睡眠期最为明显，四个区域的cAMP水平均表现出同步的、显著的ISO(图3L)。

为了研究这种独特的振荡模式是否更广泛地观察到在其他区域，研究人员进一步测量了基底外侧杏仁核（basal lateral amygdala,BLA）和纹状体在睡眠-觉醒周期中的cAMP动态。结果只在BLA (图3J-L)中发现ISO的cAMP振荡，而在纹状体中没有发现(图S3)。这些发现表明，cAMP信号在海马-皮层网络中广泛同步，特别是在NREM睡眠期间。这些相互连接的脑区之间细胞内信号动态的协调模式可能反映了睡眠依赖性记忆巩固过程中记忆的重新激活和重新分布的重要神经生理机制。

Fig3. 睡眠过程中cAMP振荡具广泛同步性

海马和皮层区域cAMP信号的全局同步性提示可能存在一个共同的驱动源。已知神经调质信号在大脑皮层区域呈现同步释放，研究人员记录了睡眠-觉醒周期中主要的神经调节信号，包括乙酰胆碱(ACh)，去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)，希望找到cAMP动态的可能驱动因素。通过对比NREM期振荡的cAMP活性和REM期睡眠中的最低水平与几种神经调节信号的动态匹配，证实可能是NE和5-HT，而非Ach是睡眠期间cAMP增加的主要驱动力。

为了进一步验证这两种信号的相关性，研究人员首先使用光纤光度计同时测量同一小鼠的cAMP和NE水平来检测NE信号在驱动cAMP信号中的作用。NE的测量使用了一种基于G蛋白偶联受体激活的NE传感器—GRABNE(图4A)。结果显示，两种信号高度相关，特别是在NREM睡眠期间。值得注意的是，在6s 中，NE信号的峰值先于cAMP峰值，这表明NE可能在睡眠期间升高cAMP信号中起关键作用(图4F和4G)。在此基础上，研究人员进一步探索了可能参与cAMP水平动态的特异性肾上腺素能受体亚型。通过单细胞RNA-seq分析证实β1受体在海马和皮层中高表达(图S4C)。接着通过腹腔注射选择性β1受体拮抗剂倍他洛尔阻断β1受体，同时记录来自双侧CA1区的cAMP和GCaMP信号。结果显著降低NREM睡眠期间cAMP信号的幅度，而GCaMP信号无明显影响(图4H -4J)。此外，倍他洛尔在不影响NE振荡的情况下也显著降低了cAMP信号中ISO的功率，并且cAMP和NE信号动力学之间的相关性不受影响(图S4I-M)。在节律持续存在的情况下，ISO的振幅降低，表明NE主要影响cAMP振荡的振幅，并有其他机制控制节律(图4H-4J和S4I-S4L)。此外，阻断β1受体引起mPFC中cAMP信号降低(图4K)。

然而，与NE信号的关键参与相反，能够增加海马中cAMP水平的5-HT受体( 5-HT4R和5-HT7R)的药理学阻断并未显著降低cAMP信号(图S4D-H)。以上结果表明，通过β1受体的去甲肾上腺素信号可能参与NREM睡眠期间的全局同步的低频cAMP水平振荡。

Fig4. NE信号是睡眠中cAMP水平动态变化的基础

上述结果证实cAMP在NREM期间表现出独特的特征，并与多种神经调质的释放同步，表明cAMP和这些神经调质可能均参与了NREM相关记忆巩固过程的神经可塑性。研究人员假设NREM睡眠的不同亚状态可能在记忆巩固中发挥不同的作用，在本实验中，可能存在cAMP水平较低的时期(NREM^cAMP-trough)比cAMP水平较高的时期( NREM^cAMP-peak)更有利于记忆巩固，原因在于NREM中cAMP高峰期存在更多的促塑性细胞外和细胞内条件。为了验证这一猜想，研究人员对小鼠进行海马依赖的空间记忆任务训练，并在训练后睡眠3 h的NREM^cAMP-peak期间选择性抑制CA1区的神经活动，最后检测小鼠的记忆表现(图5A )。利用光遗传学方法激活双侧CA1区的GABA能神经元，有效抑制海马神经元活动。在NREM睡眠cAMP振荡的高峰期或低谷期对CA1区施加光遗传刺激，两组小鼠分别命名为“cAMP-peak”和“cAMP-trough”(图5B )。本研究中cAMP信号的振荡相位定义峰值为0 ,负相位对应上升信号,正相位对应下降信号)。对测试结果进行事后分析（Post hoc analyses），结果表明，cAMP-peak组的激光刺激的平均相位为-6 ± 0.90(图5C)，持续时间为7.9 ± 0.27s，而cAMP-trough组的激光刺激的相位和持续时间分别为165.7 ± 0.39和12.8 ± 0.31s (图5C)。记忆测试中，cAMP-peak组小鼠展现较差的记忆(图5D)。相反，cAMP-trough组的小鼠表现出对新位置的显著偏好，与对照组小鼠相似(图5D-E)。

为什么cAMP-peak组存在记忆缺损呢？由于光遗传学抑制海马CA1区活动对激光期间的睡眠-觉醒状态(图5F)、不同实验组之间的整体睡眠结构(图S6E)或有助于记忆巩固的EEG特征(图S5D和S5G)期间的EEG SWA(图5G)和纺锤体(从视皮层)均未造成显著改变，研究人员首先排除了睡眠完整性破坏或睡眠振荡的改变对记忆产生不利影响等非特异性效应。

另一个可能的解释是，抑制CA1活动干扰了海马涟波（hippocampal ripples）。因此，研究人员进一步检测了光遗传刺激对涟波的影响。cAMP-peak组和cAMP-trough组的光遗传学抑制CA1活性均显著降低了光遗传刺激期间涟波的发生率。不同的是，cAMP-peak组光遗传刺激引起了即时的抑制 (图S5J和S5M)，这可能是导致观察到的记忆障碍的原因，表明抑制(相对于cAMP振荡的相位)的时机在决定对记忆巩固的影响方面至关重要。同样，光遗传刺激降低了cAMP-peak组(图S6G-H)和cAMP-trough组的cAMP水平(图S6G-H)，这种降低可能导致记忆受损。由于只在cAMP-peak组观察到记忆缺陷，而没有在cAMP-trough组观察到记忆缺陷，再次证明了峰值时间窗的重要性。此外，光遗传刺激在cAMP-trough组还诱导了统计学上显著的纺锤波抑制(图S5D,S5G)；然而，刺激停止后纺锤波出现反弹。使用多种方法估计时，在整个学习后睡眠期间，纺锤波的发生率在cAMP-peak组和cAMP-trough组之间没有统计学差异(图5H-I,S5E,S5H)。

总之，这些发现表明，在cAMP振荡的高峰期，而不是低谷期，海马的活动对于巩固海马依赖的空间记忆至关重要，证实NREM^cAMP-peak期间的特定时间窗优先促进记忆巩固过程。

Fig5. cAMP振荡高峰期的海马激活是睡眠依赖性记忆巩固所必需的

Fig6. 在cAMP振荡的高峰期，海马-皮层的相互作用增强

03 主要结论

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