We thank Dr. Jianming Zeng (University of Macau), and all the members of his bioinformatics team, and biotrainees, for generously sharing their experience and codes.
文章信息
本研究通过单细胞RNA测序识别出7种主要的细胞类型，并描绘了LUSC微环境的免疫景观。结果发现：
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一种免疫抑制受体，T细胞免疫球蛋白和基于酪氨酸的免疫受体抑制基序结构域（TIGIT），在调节性T细胞（Tregs）和耗竭的CD8+T细胞中高表达，这表明TIGIT的上调可能促进免疫抑制微环境，并抑制CD8+T细胞的细胞毒性能力。 -
在肿瘤区域识别出以CXCR2、CSF3R和CXCL8为特征的肿瘤相关中性粒细胞（TAN），并且TAN上调了白细胞介素1受体拮抗剂（IL1RN）的表达，这表明TAN可能通过表达IL1RN发挥免疫抑制作用。 -
SPP1+巨噬细胞（SPP1+M）的数量在肿瘤微环境中显著增加，这与患者的不良生存率相关。 -
基于SPP1+M的调控网络揭示了肿瘤组织和正常组织之间存在几种配体-受体对的差异。在这些配体-受体对中，SPP1-CD44在SPP1+M与其他细胞类型之间显示出最多的相互作用。
「题目」：Single-cell RNA sequencing analysis revealed cellular and molecular immune profiles in lung squamous cell carcinoma
「日期」：2023 Jan:27
「URL」：10.1016/j.tranon.2022.101568.
「单位」：武汉大学人民医院胸外科，武汉大学人民医院病理科
使用的数据
从13名个体中获取了15个样本，包括9个正常组织样本和6个肿瘤组织样本，用于分析，其他详细的临床特征也展示在补充表2中。
主要结果
图一：单细胞转录组分析LUSC和正常组织
单细胞转录组测序获得了39,574个细胞，被划分为28个不同的细胞簇（图1a）。其中，10,810个来自原发肿瘤组织，其余来自正常肺组织（图1b）细胞注释如下：
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epithelial（EPCAM、SFTPA1、AGER和KRT18）、 -
endothelial（PECAM1和VWF）、 -
成纤维细胞（COL1A2）、 -
B细胞/浆细胞（CD79A和IGHG1）、 -
肥大细胞（MS4A2）、 -
髓系细胞（CD68和LYZ）以及 -
淋巴细胞（T细胞）/自然杀伤细胞（NK细胞）（CD3D、TRBC1、FCGR3A和KLRD1）（图1c）。
图1d-f展示了肿瘤和正常组织中每个组的频率和比例。重要的是，在比较患者之间时，每个细胞亚簇的比例存在很大差异（图1d、e）。我们还发现，髓系细胞和T/NK细胞是LUSC和正常肺组织中最常见的细胞类型。
图二：T细胞亚群分析
对13,877个T/NK细胞（占所有细胞的35.1%）进行了重新聚类，得到了9个不同的细胞簇（图2a），注释结果如（图2c）。图2b和2d分别展示了肿瘤和正常组织中每个细胞亚簇的频率和比例。
e. 分别来自TCGA队列的肿瘤和正常组织中调节性T细胞（Tregs）、CD8+效应T细胞和耗竭的CD8+ T细胞的丰度比例。（通过Wilcoxon检验估计正常组织和肿瘤组织之间的差异）。
f. 小提琴图显示了单细胞RNA测序数据中T/NK细胞中TIGIT的表达（按样本来源着色）。
g. 免疫组化（IHC）染色显示了肿瘤和正常组织中TIGIT的表达。
h. TIGIT的高表达水平与来自独立队列的复发自由生存率较低相关。
图三：肿瘤相关中性粒细胞（TANs）分析
髓系细胞被重新聚类为17个不同的亚群（图3a），进一步被分类为：
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FABP4+巨噬细胞（FABP4+M）（C0、C2、C6和C16） -
单核/巨噬细胞（C4和C5） -
单核细胞（C8和C12） -
SEPP1+巨噬细胞（SEPP1+M）（C1） -
SPP1+巨噬细胞（SPP1+M）（C3） -
中性粒细胞（C11） -
CD141−CD1C−树突状细胞（DC）（C10） -
CD1C+树突状细胞（DC）（C9） -
CLEC9A+树突状细胞（DC）（C13） -
GZMB+树突状细胞（DC）（C14）和LAMP3+树突状细胞（DC）（C15）
e. 分别展示了TCGA LUSC队列中肿瘤和正常组织中中性粒细胞的比例的箱线图。
f. 分别来自肿瘤和正常组织的中性粒细胞簇的炎症相关基因和N2特征的模块评分。
g. 分别在TCGA LUSC队列中，中性粒细胞与CXCR2（上）/CXCL8（下）表达水平之间的相关性（通过Pearson检验计算相关系数和差异）。
h. 热图显示了不同单核/巨噬细胞组之间，通过GSVA为每个细胞评分的通路活性的差异。
i. 分别展示了TCGA LUSC队列中肿瘤和正常组织中SPP1+M、SEPP1+M和FABP4+M的比例的箱线图。
j. TCGA LUSC队列中细胞丰度与患者生存之间的关联（通过log-rank检验计算P值）。
图四：五种树突状细胞（DC）
本研究中发现了五种树突状细胞（DC）类型，包括：
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CD1C+ DC细胞（CD1C、CLEC10A和FCER1A） -
LAMP3+ DC（LAMP3、IDO1、CCR7和FSCN1） -
GZMB+ DC（GZMB、CXCR3、IRF4和CLEC4C） -
CLEC9A+ DC -
CD141−CD1C− DC
a：CD1C+ DCs、GZMB+ DCs和CLEC9A+ DC在肿瘤组织中的比例显著更高，而LAMP3+ DCs和CD141−CD1C− DCs在肿瘤和正常组织之间没有显著差异
b：生存分析显示在TCGA LUSC队列中，GZMB+ DC和CD141−CD1C− DC的高丰度预测了较差的总生存率（OS）和疾病特异性生存率（DSS）
c：GO富集分析显示所有DC都参与了免疫反应，CD141−CD1C− DCs的特征是调节白细胞介素-6的产生和肥大细胞脱颗粒，而GZMB+ DCs的特征是调节对内质网应激的反应和泛素依赖的内质网介导的降解途径
图五：B淋巴细胞和浆细胞分析
对2418个B淋巴细胞和浆细胞进行了重新聚类（图5a），并识别出五个不同的细胞簇。C0被定义为IGHGP+浆细胞（IGHGP、IGHG1、CD79A），C3为TXNDC5+浆细胞（TXNDC5、JCHAIN、IGHG1和CD79A）。C2被表征为滤泡B细胞（CD79A、MS4A1、CD69和CD24）（图5b、5c以及补充图8A）。「由于质量较低，C4和C5无法被准确定义。」图5d展示了每种细胞亚型的频率和比例。
e. 肿瘤和正常组织中3种B/浆细胞亚型的细胞丰度差异。 f. 通过Monocle预测的分化轨迹。 g-i. 分化轨迹按状态（g）、簇（h）和样本来源（i）分别着色。
图六：stromal 基质细胞亚群分析
基质细胞被重新聚类，获得了几个不同的簇（图6a）。根据标记基因，识别出EDN1+内皮细胞（C0、C3、C4和C5）、EDNRB1+内皮细胞（C1和C6）、CCL21+内皮细胞（C10）、PDGFRA/B+成纤维细胞（C2和C8）、肌成纤维细胞（C11）和成纤维细胞（C7和C9）（图6c）。图6b和d展示了每种亚型的分布、比例和频率。
d. 来自肿瘤和正常组织的每种细胞亚型的频率和比例。 e. TCGA LUSC队列中细胞丰度与患者生存之间的关联（通过log-rank检验计算P值）。 f. TCGA LUSC队列中肿瘤和正常组织之间肌成纤维细胞的丰度差异（通过Wilcoxon检验计算肿瘤和正常组织之间差异的显著性）。 g. 通过Monocle预测的分化轨迹。 h-j. 分化轨迹按状态（h）、样本来源（i）和簇（j）分别着色。
图7：在LUSC中构建免疫细胞的调控网络
a. 热图显示了CellphoneDB预测的细胞群之间潜在的配体-受体对的数量。
b. 气泡图显示了SPP1+M与其他细胞群之间的配体-受体分子对。
c. 小提琴图分别显示了单细胞RNA测序数据中CD44和SPP1的表达（按样本来源着色）。
d. 分别来自HPA的肿瘤和正常组织中CD44的免疫组化（IHC）染色。
e. 在LUSC肿瘤微环境中预测的调控网络。
小结
「这篇文章描绘了LUSC中免疫细胞的图谱，并构建了调控网络。」该图谱揭示了促进LUSC中肿瘤细胞免疫逃逸的免疫抑制细胞的特征。据我们所知，这提供了最全面的LUSC细胞间相互作用图，并为未来发现LUSC治疗的分子和细胞治疗靶点提供了框架。
「怎么说呢，所有的亚群都分析了一遍。」