该研究从基因组层面评估了虫草属物种中潜在毒素化合物的安全性。通过对虫草属18个菌株的全基因组进行测序与注释，将其基因组序列与该属其他6个菌株进行基本特征比较分析，进一步利用antiSMASH和本地BLAST工具对主要次级代谢产物相关基因簇进行了系统解析。结果表明，虫草属不同物种在基因组大小及GC含量方面存在显著差异，且亲缘关系越近的物种，其基因组特征的相似性越高。所有24个虫草属菌株均为野生菌株，未检测到与致癌性相关的基因家族。此外，蝉花虫草（Cordyceps cicadae (Miq.) Massee）YFCC 8436、蝉花虫草（C. cicadae）CC02、蛹虫草（C. militaris (L.) Fr.）YFCC 9073、蛹虫草（C. militaris）CM01、细脚虫草（C. tenuipes (Peck) Kepler, B. Shrestha & Spatafora）YFCC 17002、细脚虫草（C. tenuipes）YFCC DH05、细脚虫草（C. tenuipes）YFCC TL08、细脚虫草（C. tenuipes）YFCC YY02、扣孢虫草（C. bullispora Hong Yu bis, Q.Y. Dong & Zhi Yuan Zhao）YFCC 8400、环链虫草（C. cateniannulata (Z.Q. Liang) Kepler, B. Shrestha & Spatafora）YFCC 8719、粉质虫草（C. farinosa (Holmsk.) Kepler, B. Shrestha & Spatafora）YFCC 8744、玫烟色虫草（C. fumosorosea (Wize) Kepler, B. Shrestha & Spatafora）YFCC 8438、玫烟色虫草（C. fumosorosea）YFCC 8745、玫烟色虫草（C. fumosorosea）ARSEF 2679、长梗虫草（C. longiphialis Hong Yu bis, Q.Y. Dong & D.X. Tang）YFCC 8402、纳板河虫草（C. nabanheensis Hong Yu bis & Q.Y. Dong）YFCC 8410、新粉被虫草（C. neopruinosa Mongkols., Noisrip., Khons. & Luangsa-ard）YFCC 8443、拟细脚虫草（C. pseudotenuipes Hong Yu bis, Q.Y. Dong & Yao Wang）YFCC 8404、假细脚虫草（C. subtenuipes H. Yu, Y.B. Wang, Y. Wang, D.E. Duan & Zhu L. Yang）YFCC 8445、萨帕虫草（Hong Yu bis, Y. Wang & Q.Y. Dong）YFCC 1610884以及思茅虫草（C. simaoensis Hong Yu bis, Q.Y. Dong & Z.Q. Wang）YFCC 8406可能含有编码一种或多种潜在毒素化合物的生物合成基因簇，可能导致寄主出现病态或死亡。而斜链虫草（C. cateniobliqua (Z.Q. Liang) Kepler, B. Shrestha & Spatafora）YFCC 8434、爪哇虫草（C. javanica (Bally) Kepler, B. Shrestha & Spatafora）YFCC 8439和爪哇虫草IJ1G则具有作为新型食品原料开发的潜力。本研究从基因组水平对虫草属真菌的潜在毒素化合物进行了系统安全性评估，为后续药食同源菌株的应用与开发提供了理论依据。
虫草属18个基因组基本特征
该研究对虫草属18个菌株进行全基因组测序与组装，结果表明，不同虫草物种之间的基因组大小存在显著差异，范围在28.35至41.10 Mb之间，而GC含量和基因总数的差异则相对较小（见表1）。通过对这18个全基因组的编码基因进行功能注释分析发现，这些基因广泛参与了遗传信息处理、信号传导以及碳水化合物代谢等多个关键生命活动过程，从而为虫草在生态系统中的作用及其生物活性表现提供了重要的基因组层面的依据。进一步通过PHI分析（见图1）显示，这18个虫草菌株的主要注释基因为毒力减弱基因和对致病性无显著影响的基因，表明这些菌株不具备高致病性。该结果初步从基因水平支持蛹虫草和蝉花虫草作为药食同源材料的安全性。
表1 虫草属物种18个菌株全因组组基本特征
图1 虫草属18个全基因组序列病原体PHI表型突变类型分布图。
虫草属24个基因组基本特征
将18个基因组与公共数据库中虫草属6个物种的基因组进行比较分析，结果表明不同物种在基因组大小方面存在显著差异，其中细脚虫草YFCC DH05的基因组最大，蝉花虫草YFCC 8436最小（见表2）。在GC含量方面，粉质虫草YFCC 8744最高，新粉被虫草YFCC 8443最低。此外，在蛹虫草、蝉花虫草、细脚虫草、玫烟色虫草和爪哇虫草不同菌株之间，基因组大小与GC含量亦表现出明显变异。
表2 虫草属24个全基因组基本特征
潜在毒素化合物生物合成基因簇分析
通过 antiSMASH 和 BLAST 分析，从虫草属24个菌株基因组中鉴定出六个与毒素类化合物相关的潜在基因簇。这些基因簇分别对应于伏马菌素、伏马菌素 B1、稻曲病病原菌毒素 B、白僵菌素、绿垂毒素、玫烟色菌素以及 sirodesmin PL。
伏马菌素是一种霉菌毒素，已知对动物有毒，对啮齿类动物有致癌作用，并在 LM/Bc 小鼠中引起神经管缺陷。伏马菌素 B1 是伏马菌素中含量最丰富和毒性最强的变体，会破坏鞘脂的从头生物合成。分析表明，球孢虫草 YFCC 8400 的 26.1 区域、爪哇虫草 YFCC 8439 的 4.1 区域和爪哇虫草 IJ1G 的 7.1 区域包含与伏马菌素催化合成相关的基因片段，相似性较低（分别为 12%、11% 和 11%）。扣孢虫草YFCC 8400没有可识别的关键酶外显子，无法进行进一步分析。将爪哇虫草 YFCC 8439 的 4.1 区域和爪哇虫草 IJ1G 的 7.1 区域与已知基因簇 EU449979.1 进行比较，发现存在显著差异。EU449979.1 的关键酶被确认为 HR-PKS（KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP），而爪哇虫草 YFCC 8439 的 4.1 区域和爪哇虫草 IJ1G 的 7.1 区域的关键酶为杂合 PKS-NRPS（KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-P-Te）。此外，爪哇虫草 YFCC 8439 的 4.1 区域和爪哇虫草 IJ1G 的 7.1 区域均不包含伏马菌素合成所需的基因，即Fum2、Fum3、Fum6、Fum7、Fum8、Fum10、Fum11、Fum13、Fum14、Fum15、Fum16、Fum17、Fum18、Fum19、Fum21和Cpm1。推测爪哇虫草可能不产生伏马菌素等致癌化合物。
稻曲病病原菌毒素B 是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）产生的一种次生代谢物，是一类环状肽毒素，可阻断真核细胞的有丝分裂活动。具有较强的细胞毒性，对人类、动物和植物都有显著毒性。研究结果表明，蛹虫草 YFCC 9073、蝉花虫草 YFCC 8436、细脚虫草 YFCC DH05、细脚虫草 YFCC TL08、细脚虫草 YFCC YY02、扣孢虫草 YFCC 8400、思茅虫草 YFCC 8406、纳板河虫草 YFCC 8410、假细脚虫草 YFCC 8445、环链虫草 YFCC 8719、粉质虫草 YFCC 8744、萨帕虫草YFCC 1610884、斜链虫草 YFCC 8434、玫烟色虫草 YFCC 8438、烟色虫草 YFCC 8745 和新粉被虫草 YFCC 8443存在能够催化稻曲病病原菌毒素B 合成的推定生物合成基因簇。由于缺乏稻曲病病原菌毒素B 合成的关键酶基因，无法进行进一步分析。
白僵菌素是一种环寡聚沉积肽离子载体，作为自由载体通过膜运输单价阳离子，从而解偶联氧化磷酸化过程。由于其能够感染和损害呼吸道、消化道，经常作为生物杀虫剂使用。分析发现，蝉花虫草 YFCC 8436 的 38.1 区域、蝉花虫草 CC02 的 87.1 区域、细脚虫草 YFCC 17002 的 63.1 区域、细脚虫草 YFCC DH05 的 12.1 区域、细脚虫草 YFCC TL08 的 47.1 区域、细脚虫草 YFCC YY02 的 78.1 区域、扣孢虫草 YFCC 8400 的 5.1 区域、拟细脚虫草 YFCC 8404 的 44.1 区域、思茅虫草 YFCC 8406 的 72.1 区域、纳板河虫草 YFCC 8410 的 37.1 区域、环链虫草 YFCC 8719 的 8.1 区域、粉质虫草 YFCC 8744 的 21.1 区域、玫烟色虫草 YFCC 8438 的 25.1 区域、玫烟色虫草 YFCC 8745 的 1.1 区域、玫烟色虫草 ARSEF 2679 的 1.1 区域、假细脚虫草 YFCC 8445 的 15.1 区域、长梗虫草 YFCC 8402 的 14.1 区域和新粉被虫草 YFCC 8443 的 6.1 区域与负责催化合成白僵菌素的基因簇（GenBank：EU886196.1）具有高度同源性，相似性为 40% 至 90%。然而，由于假细脚虫草 YFCC 8445 中未发现 NRPS 基因，因此无法对该物种的 15.1 区域进行进一步分析。催化合成白僵菌素的 NRPS 结构域为C-A-P-C-A-MT-P-P-C，而虫草属物种的结构域略有不同（图 2）。催化白僵菌素的修饰基因只有一个基因片段同时表达 Indigoidine_A 和 WD40 活性，其他修饰基因通常每个功能包含一个基因片段。然而，蝉花虫草 YFCC 8436 的 38.1 区域、蝉花虫草 CC02 的 87.1 区域、细脚虫草 YFCC 17002 的 63.1 区域、细脚虫草 YFCC DH05 的 12.1 区域、细脚虫草 YFCC TL08 的 47.1 区域、细脚虫草 YFCC YY02 的 78.1 区域、扣孢虫草 YFCC 8400 的 5.1 区域、拟细脚虫草 YFCC 8404 的 44.1 区域、思茅虫草 YFCC 8406 的 72.1 区域、纳板河虫草 YFCC 8410 的 37.1 区域、环链虫草 YFCC 8719 的 8.1 区域、粉质虫草 YFCC 8744 的 21.1 区域、玫烟色虫草 YFCC 8438 的 25.1 区域、玫烟色虫草 YFCC 8745 的 1.1 区域、玫烟色虫草 ARSEF 2679 的 1.1 区域、长梗虫草 YFCC 8402 的 14.1 区域和新粉被虫草 YFCC 8443 的 6.1 区域的修饰基因在位置和方向上表现出可变性，有些情况下单个基因可能表达两种功能。值得注意的是，蝉花虫草 YFCC 8436 的 38.1 区域和蝉花虫草 CC02 的 87.1 区域与白僵菌素生物合成基因簇的相似性分别为 60% 和 50%。在虫草属16个物种 24 个基因组中，扣孢虫草与白僵菌素生物合成基因簇的相似性为 90%。相反，在蛹虫草、斜链虫草、爪哇虫草和萨帕虫草中未发现与白僵菌素生物合成基因簇高度相似的同源区域。
图2 虫草属物种中白僵菌素假定生物合成基因簇比较和结构式。区域后面小数点前的数字表示scaffolds的数值，小数点后的数字表示潜在基因簇的数值。
Sirodesmin PL 是由油菜茎基溃疡病（Leptosphaeria maculans）产生的一种植物毒素和霉菌毒素。这种植物毒素属于由真菌（包括哺乳动物和植物病原体）产生的表聚硫代二氧代哌嗪类化合物。研究发现，扣孢虫草 YFCC 8400 的 16.1 区域、环链虫草 YFCC 8719 的 4.1 区域、粉质虫草 YFCC 8744 的 12.1 区域、长梗虫草 YFCC 8402 的 30.1 区域和新粉被虫草 YFCC 8443 的 34.1 区域均与负责合成 sirodesmin PL 的生物合成基因簇（GenBank：AY553235.1）高度相似（77%–83%）（图 3）。然而，在蝉花虫草、蛹虫草、细脚虫草、斜链虫草、玫烟色虫草、爪哇虫草、纳板河虫草、拟细脚虫草、萨帕虫草、思茅虫草和假细脚虫草中均未发现与 sirodesmin PL 生物合成基因簇高度同源的区域。分析表明，sirodesmin PL生物合成基因簇的关键酶 NRPS 和修饰基因是独立的。其中，环链虫草 YFCC 8719 的 4.1 区域、粉质虫草 YFCC 8744 的 12.1 区域和新粉被虫草 YFCC 8443 的 34.1 区域的 NRPS 和修饰基因中存在基因嵌合现象。此外，扣孢虫草 YFCC 8400 的 16.1 区域、环链虫草 YFCC 8719 的 4.1 区域、粉质虫草 YFCC 8744 的 12.1 区域、长梗虫草 YFCC 8402 的 30.1 区域和新粉被虫草 YFCC 8443 的 34.1 区域中的一个修饰基因可能表达多种蛋白质活性。
图3 虫草属物种中sirodesmin PL假定生物合成基因簇比较和结构式。区域后面小数点前的数字表示scaffolds的数值，小数点后的数字表示潜在基因簇的数值。
绿垂毒素是从绿垂曲霉（Aspergillus viridinutans）中分离出的一种次生代谢物，是一种由 PKS 催化合成的次生代谢物生物合成基因簇，已被证明能够抑制细菌中的 FtsZ 蛋白，该蛋白是真核微管蛋白的同源物。研究发现蛹虫草 YFCC 9073 的 232.1 区域、蛹虫草 CM01 的 95.1 区域、蝉花虫草 YFCC 8436 的 219.1 区域、蝉花虫草 CC02 的 117.1 区域、细脚虫草 YFCC 17002 的 38.1 区域、细脚虫草 YFCC TL08 的 81.1 区域、细脚虫草 YFCC YY02 的 40.1 区域、纳板河虫草 YFCC 8410 的 36.1 区域、假细脚虫草 YFCC 8445 的 31.1 区域、玫烟色虫草 YFCC 8438 的 33.1 区域、玫烟色虫草 YFCC 8745 的 11.1 区域、玫烟色虫草 ARSEF 2679 的 58.1 区域、长梗虫草 YFCC 8402 的 15.1 区域、新粉被虫草 YFCC 8443 的 55.1 区域和萨帕虫草 YFCC 1610884 的 19.1 区域可能是催化合成绿垂毒素的基因簇（图 4）。由于萨帕虫草 YFCC 1610884 中未发现 PKS 基因，因此无法对该物种的 19.1 区域进行进一步分析。催化合成绿垂毒素的 NR-PKS 结构域排列为SAT-KS-AT-PT-ACP-ACP-ACP，而虫草属与其类似的基因片段会缺失某些结构域。同时，虫草属中这些相似基因簇内的修饰基因表现出一个显著现象，即单个基因可编码多种蛋白质活性。作为药食两用真菌的蛹虫草和蝉花虫草，其基因组中拥有与绿垂毒素生物合成基因簇高度相似的同源区域。具体而言，蛹虫草 CM01 的 95.1 区域与绿垂毒素生物合成基因簇的相似性为 33%，而蛹虫草 YFCC 9073 的 232.1 区域、蝉花虫草 YFCC 8436 的 219.1 区域和蝉花虫草 CC02 的 117.1 区域的相似性均为 66%。纳板河虫草 YFCC 8410 的 36.1 区域、长梗虫草 YFCC 8402 的 15.1 区域和新粉被虫草 YFCC 8443 的 55.1 区域的相似性最低，均为 22%。此外，在细脚虫草 YFCC DH05、扣孢虫草 YFCC 8400、环链虫草 YFCC 8719、斜链虫草 YFCC 8434、粉质虫草 YFCC 8744、爪哇虫草 YFCC 8439、爪哇虫草 IJ1G、拟细脚虫草 YFCC 8404 和思茅虫草 YFCC 8406 中未发现与绿垂毒素生物合成基因簇高度同源的区域。
图4 虫草属物种中绿垂毒素假定生物合成基因簇比较和结构式。区域后面小数点前的数字表示scaffolds的数值，小数点后的数字表示潜在基因簇的数值。
图5 虫草属物种中绿垂毒素假定生物合成基因簇比较和结构式。区域后面小数点前的数字表示scaffolds的数值，小数点后的数字表示潜在基因簇的数值。
聚类分析
图6 虫草属物种PKS或杂合PKS-NRPS蛋白序列与其他真菌PKS或杂交PKS-NRPS蛋白序列采用最大似然法构建聚类分析树。节点处的值代表自展值。比例尺0.6表示每个位点的预期突变数。Fusarium fujikuroi SCO54200和Fusarium fujikuroi XP_023434892作为外类群。
图7 虫草属物种NRPS蛋白序列与其他真菌NRPS蛋白序列采用最大似然法构建聚类分析树。节点处的值代表自展值。比例尺0.4表示每个位点的预期突变数。Pseudomonas sp. SDZ72054.1和Pseudomonas sp. PMU87181.1作为外类群。
3 种虫草有望成为新食材
尽管部分虫草属物种存在潜在的毒性风险，研究表明，斜链虫草YFCC 8434、爪哇虫草YFCC 8439 和爪哇虫草IJ1G 这三个虫草菌株在基因组层面未检测到与寄主致病或死亡相关的有毒化合物基因簇。这一发现表明，它们在未来食品工业中具有广泛应用潜力，可为人类提供更加多元化和安全的食材及药用资源。
从基因到餐桌，任重道远
真菌能够产生多种次生代谢物，通过基因组挖掘技术可以快速、高效地鉴定与这些次生代谢物生物合成相关的基因簇。然而，从真菌基因组中识别聚酮合酶（PKS）或非核糖体多肽合酶（NRPS）基因，并进一步鉴定其编码的聚酮类或非核糖体多肽类化合物，仍然是当前研究面临的重要挑战。该研究聚焦于虫草属物种中潜在毒素化合物的基因组挖掘工作。目前在基因组层面上对虫草属物种的安全性评估仍较为有限。初步研究结果显示，所分析的24株虫草属菌株可能缺乏已知的致癌基因，但仍需进一步实验加以验证。此外，在自然环境及实验室条件下，真菌中的大多数PKS或NRPS基因通常处于沉默状态，表达水平极低，难以检测。这些沉默基因可能编码具有重要生物学功能的毒素或新型药物分子，因此有必要通过异源表达或基因敲除等手段进行功能验证。已有文献报道，服用蝉花虫草的患者主要出现头晕、恶心和呕吐等不良过敏反应。尽管蛹虫草和蝉花虫草已被列入药食同源菌株目录，但它们仍存在产生病样症状或导致寄主死亡的潜在毒素化合物。目前已在蝉花虫草中分离出白僵菌素等有毒成分。这些毒素是否对人体健康构成威胁仍有待深入研究，后续应开展动物急性毒理实验以明确其毒性作用。
研究论文A complete genome analysis of toxic compound gene families in the genus Cordyceps在线发表于Journal of Food Biochemistry（IF = 3.5, JCR = 2）。云南民族大学虞泓教授、云南民族大学樊保敏教授和云南省阜外心血管病医院内科管委会主任牛国栋教授为该论文通讯作者，通讯单位为云南民族大学化学与环境学院云百草实验室，云南大学陆莹玲博士生和李松宇硕士生为该论文共同第一作者。研究工作得到国家自然科学基金项目（No. 32200013和31870017）、云南省科学技术厅（202402AN360010和202401BC070018），云南大学研究生科研创新基金（KC-23235594）支持。文章链接：https:///10.1155/jfbc/9371774。