1 CytoAnalyst: 一站式“云端+智能”平台助力单细胞RNA测序分析
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文章：CytoAnalyst web platform facilitates comprehensive single cell RNA sequencing analysis
链接：https://www./articles/s41598-025-14398-x
在单细胞RNA测序（scRNA-seq）逐渐成为生命科学和精准医学研究“标配”的今天，科研人员面临的现实困境却愈发突出：数据规模巨大、分析流程冗长、批次效应难以校正、细胞类型注释耗时依赖经验、协作低效且复现性管理不足。新近发布的CytoAnalyst平台正是在这样的大背景下应运而生。它并不是又一个“功能堆砌”的可视化工具，而是试图把数据上传、质量控制、标准化、整合、降维、聚类、差异分析、功能解释、细胞注释、轨迹推断、可视化展示与团队协作管理整合到一个统一、可复现、可共享的高性能交互式工作环境中，让“把结果看清楚”“把流程走规范”“把协作做顺畅”“把结论说扎实”成为常态。
从入口体验开始，CytoAnalyst支持主流原始或处理后数据格式：10X Genomics输出（包括矩阵及特征/条形码文件，或.h5压缩形式）与AnnData对象（.h5ad），并允许附带元信息（如样本条件、个体编号、疾病分期、处理组、库制备批次等）的表格（.csv/.tsv）。上传后系统提供即时数据预览与一致性检查，帮助用户在正式计算前发现缺失列、命名冲突或异常分布。质量控制阶段，平台内置常用过滤指标：每个细胞检测到的基因数量（反映测序深度与活性）、UMI总数（反映捕获量）、线粒体基因比例（提示潜在凋亡或破裂细胞）、核糖体基因比例（评估翻译活跃性偏倚）。这些参数均可交互调节，调整阈值时平台实时反馈保留与剔除细胞数量，让筛选从“拍脑袋”变成“可视化决策”。
在标准化与整合环节，CytoAnalyst允许用户选择轻量级对数归一（log-normalization）或更稳健的基于方差建模的SCTransform方法；多样本、多批次整合可选择CCA（典型相关分析）、RPCA（减少内存占用的PCA变体）、Harmony（迭代消除批次信号）等算法。系统将参数配置持久化，既便于回溯也支持“复制—修改—再比较”的实验策略。整合完成后，用户可并行生成多个降维嵌入（PCA、UMAP、t-SNE），在同一屏幕网格布局中对比不同参数（如邻居数、最小距离、分辨率）对聚类结构的影响，从而“看懂”而不是“盲信”某一个坐标结果。
聚类模块集成Louvain与Leiden算法（后者在分辨率调节和稳定性上更优），用户可以同时跑出一组不同分辨率的聚类方案并并排查看：哪些小簇在高分辨率下出现、是否为真实生物异质性、是否由低质量或双细胞（doublet）驱动。系统支持设置标记基因快速高亮；配合表达梯度渲染与密度视图叠加，帮助判断聚类边界的生物合理性。差异表达分析阶段，平台实现了常用的Wilcoxon秩和检验等统计方法，并清晰呈现log2倍数变化、假阳性调整后的显著性（FDR/Q值）、平均表达与检出率（%细胞表达），同时允许用户导出火山图、MA图与热图的参数模板，实现“可视化风格复用”。基因集管理支持用户上传自定义marker列表、通路集合（如MSigDB子集）并分类归档；富集分析模块可对差异基因进行GO、KEGG、Reactome等功能解释，界面同时展示条形图、气泡图与富集网络（相似功能项的聚类），减少在不同软件间反复跳转。
细胞类型注释历来是初学者的“劝退点”。CytoAnalyst的AI模块通过综合：1）用户挑选或自动筛选出的簇特征基因，2）内置或用户上传的参考marker数据库（按组织、系统、免疫谱系、干细胞层级等归类），3）机器学习推断（相似性评分、加权匹配、置信度排名），生成候选细胞类型建议清单，并标注支持该判断的核心证据基因（区分性、特异性权重）。用户可一键接受、部分采纳或自定义覆盖，并将决策理由写入“annotation note”字段，后续任何协作者或审稿人都可追溯该注释的证据链。对多轮迭代（如先粗分免疫/间质/上皮，再对免疫簇二次分群）的使用场景，平台保留层级注释历史，方便构建层次型细胞类型树。
动态过程解析方面，CytoAnalyst采用Slingshot进行伪时序轨迹推断。与一些“黑盒”式工具不同，平台允许用户交互定义潜在起始群（如干样细胞簇）、排除噪声簇、控制拟合平滑度与分支敏感参数，并提供：伪时序嵌入曲线、分支结构拓扑图、基因沿轨迹表达趋势（平滑拟合）、分支差异基因筛选等多视角。对于存在多分化方向（如造血干细胞向髓系与淋巴系）的数据，用户可同时对比多个分支的关键调控基因模块。
可视化体验是CytoAnalyst最“抓眼球”的特征之一。其Grid（网格）布局并非简单拼图，而是支持：1）同一数据不同参数产出的图（多UMAP、多分辨率聚类、多批次整合方案）同步锁定颜色与标签；2）跨图联动（在某一个图选择细胞，其他图高亮对应点）；3）多类型叠加（例如在UMAP背景上着色轨迹伪时序、再加密度等高线）；4）主题与配色模板保存（适配期刊、投标书或课堂教学不同情境）。火山图能动态筛选阈值并即时刷新标记基因标签；热图支持行列分组与注释条（如样本来源、处理条件）。用户还可导出高分辨率矢量文件（SVG/PDF）或批量报告（整合结果图+参数摘要+方法说明），显著压缩投稿与汇报准备时间。
协作与复现层面，CytoAnalyst建立“项目—版本—实例”三层结构：项目对应一个生物学课题；版本记录重要节点（如原始处理、整合策略、注释修订）；实例是某一次参数组合的具体运行。所有参数（代码式JSON结构化存档）、数据快照（支持差异存储减少空间）、用户操作日志（谁何时修改了聚类分辨率或接受了哪条注释）都被自动记录，确保团队新人加入可快速溯源，审稿质疑可回放过程，跨机构协作减少“口头复述误差”。平台部署在高性能环境（192核CPU、3TB内存、NVMe高速存储、H100 GPU），并采用容器化隔离任务，防止大型分析互相“抢资源”。调度层支持并行多实例运行（例如对比三种批次整合法），完成后统一汇总比较指标。
案例验证方面，研发团队展示了三个具有代表性的数据场景：1）经典PBMC数据集中免疫细胞细粒度划分，AI注释与已发表参考集高度一致，并准确区分Naive与Memory T亚群；2）疾病干预或处理条件下的差异表达与通路重建，成功复现炎症与代谢通路激活格局；3）发育或分化体系中的轨迹分析，识别关键分支基因模块，并与外部文献标记相互印证。平台分析得出的结果在统计显著性、功能富集一致性、轨迹合理性方面均与原始发表研究吻合，支撑其可靠性与生物学有效性。
总体来看，CytoAnalyst的价值不在于发明某个全新算法，而在于把分散在脚本、命令行、多个R/Python包、图像编辑软件、共享网盘与内部文档里的“碎片化链条”重新编排成一个连贯、透明、协作友好且可高性能扩展的“分析操作系统”。在数据指数级增长、跨机构协作频繁、再现性审查趋严的时代，这类平台化思路将逐渐成为主流。CytoAnalyst的出现，为单细胞数据分析“从技术熟练度驱动”迈向“方法学与洞察驱动”提供了一个具有代表性的范本。随着未来多模态、空间、时序、扰动（CRISPR筛选）与大模型辅助解释的加持，这个平台有望继续演化为整合式细胞生态与功能解析中枢，加速疾病机制研究、个体化干预设计与前沿工具教育普及的全流程革新。
2 Vivo-seq首度把磷酸化信号与转录组一起装进单细胞，改写Th17命运图谱
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文章：Integration of phospho-signaling and transcriptomics in single cells reveals distinct Th17 cell fates
https:///10.1016/j.celrep.2025.116006
在传统单细胞RNA测序里，我们看到的是“结果”——哪些基因被转录，但真正驱动基因开关的是更上游、更瞬时的细胞内信号事件，例如蛋白质的磷酸化。过去这些转瞬即逝的分子“指令”在细胞制备、上机、裂解过程中往往早已消失，研究者只能事后推测。最新发表的这项研究推出一套名为Vivo-seq的创新平台，用一种深共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）化学“瞬时封存”细胞内状态，把转录信息、细胞内磷酸化信号、形态与可再探测的表位标记集合在同一个单细胞层面同时读取，首次在辅助性T细胞17（Th17）分化过程中解析出一条“早期信号共振—IL-2脉冲—命运塑形”的全新轴线。
这项工作的核心突破在于样本前处理理念的重排：不再先分离活细胞再匆忙上机，而是立即用一种DES（商品名vivoPHIX）浸润固定，在室温两小时即可完成“时间冻结”。与传统甲醛（交联易影响RNA剪切与回收）或醇类脱水（易导致RNA结构破坏）不同，DES由氢键供体与受体按特定摩尔比组合形成低熔点高黏度液体，可大量氢键置换生物大分子水合层，快速渗透、稳定构象，同时不大幅交联，因而既保住RNA完整性又不锁死表位。研究团队系统比较了三种从DES过渡到水相的策略：单纯高盐洗、类甲醇流程、以及“10%冰乙酸（AcOH）瞬断核酸酶 + 3×SSC（高盐洗脱）”组合。结果显示只有加入冰乙酸的路线能最大限度抑制再激活的核酸酶，电泳条带完整，RNA完整性指标（RIN）与实时定量PCR Ct值均与未固定新鲜细胞无显著差异，而对照流程出现不同程度降解。值得一提的是，样本可在−80°C长期储存而不结冰，后续按需排期进入单细胞建库，极大缓冲实验与测序排期矛盾。
应用到Th17细胞早期分化，Vivo-seq揭示了一个之前难以直接观测的“协同磷酸化窗口”：当ERK1/2与c-FOS在同一细胞内同步处于磷酸化激活状态时，细胞释放的IL-2水平达到峰值，并且这种IL-2高脉冲与随后IL-17产量增强呈正相关。更意外的是，研究发现早期产生较高IL-2的那一类Th17细胞在后续再次抗原刺激时表现出两种“命运偏向”：一部分维持更稳定的经典效应型特征，另一部分则显示出更强的细胞因子依赖性可塑性（转分化潜力上升）。换言之，早期的信号组合通过IL-2这一免疫调节枢纽在尚未完全定型的阶段就为未来的功能状态留下一个“水印”。
机制层面可以这样理解：ERK1/2通路与AP-1复合体成员c-FOS的协同磷酸化，可能在染色质可及性与转录因子装配上形成短暂的“超级许可”窗口，使IL2启动子与增强子协同驱动最大速率转录；IL-2自分泌/旁分泌反馈再通过STAT家族与代谢重编程影响Th17前体细胞的命运稳定度与可塑性。传统只测RNA的方法只能看到“IL2表达高的一群细胞长远命运不同”，却无法追溯“为什么高”以及“高的触发信号逻辑”；Vivo-seq通过同时捕获上游磷酸化状态与下游转录输出，把这条链条前段的动态证据补齐。
这项工作对免疫学与技术平台两个层面有多重影响。对免疫细胞命运重建：它提示“早期信号协调度”而非单一通路强度可能是决定功能稳定与可塑性的关键维度，为解析其它可塑性T细胞（如Tfh、Th1/Th17混合谱系）提供思路。对自身免疫与炎症疾病：如果在患者外周血或组织浸润T细胞中同样能识别这种“ERK1/2-c-FOS-IL-2高脉冲”指纹，或可作为病程活动度、治疗反应预测的动态指标。对细胞治疗（如CAR-T）制备：早期激活阶段通过调控信号协同窗口或可优化后续效应持久性。对方法发展：DES类绿色低毒溶剂体系为“多组学一体化”打开化学空间，未来有望进一步并入表观层（例如快速标记特定修饰）、代谢瞬态（通过固定保留代谢物分布）甚至空间转录与信号联测。
3 让小队列“说大话”：单细胞eQTL联合加权模型提升发现力
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文章：Optimized summary-statistic-based single-cell eQTL meta-analysis
链接：https://www./articles/s41598-025-08808-3
在遗传学与功能基因组学交叉的前沿，一个核心任务是找出哪些遗传变异（SNP）会改变基因在具体细胞类型中的表达——即绘制单细胞水平的eQTL图谱。然而单细胞RNA测序(scRNA-seq)天然存在每个研究队列供体（donor）数量有限、技术平台多样、化学版本不同、捕获效率差异大、背景噪声不一致等问题，导致单个数据集对细胞类型特异乃至状态特异的eQTL检出力偏低。把来自多个队列的证据联合起来是直觉解法，但直接集中原始基因型与表达矩阵不仅触及隐私与合规红线，也因实验流程差异引入额外批次偏倚。为破解这一“想联合、难合并”的瓶颈，研究团队提出并系统评估一套“基于汇总统计（summary statistics）的加权元分析（Weighted Meta-Analysis，WMA）”优化策略，希望在不触碰敏感数据的前提下最大化统计功效。
文章首先明确单细胞场景与传统大样本bulk eQTL元分析的结构性差异：单细胞数据集供体数较小，且跨平台（如10X V2、10X V3 与 Smart-seq2）在“每细胞基因检测数”与“每供体总细胞量”之间存在显著权衡——Smart-seq2基因检测深，细胞数少；10X高通量，单个细胞检测的分子数少。这样的平台异质性改变了不同基因的信噪比结构，使得沿用“样本量平方根”或“效应标准误倒数”这些bulk时代默认权重策略未必最优。作者据此提出：需要围绕单细胞特有的粒度（cells per donor, molecules per cell 等）引入新的权重维度，并在固定效应框架下系统比较。
研究工作流程分三层：第一，在各数据集内部完成常规单细胞eQTL映射，输出对每个基因–SNP配对的效应估计与统计量；第二，构建多类可选权重，涵盖传统的样本量、标准误，以及单细胞特征派生指标（每供体平均细胞数、每细胞平均分子数、每供体总分子数、队列总细胞数、队列总分子数），并进一步考虑基因或SNP层面的特征（例如基因在该平台的检测稳健度、次要等位基因频率等）；第三，将这些不同权重方案嵌入加权Z分数式元分析框架，对结果的统计功效与类型I错误控制进行基准比较，提出实践建议。作者选取两组真实数据进行代表性评估：一组是五个使用10X V2/V3化学版本的人PBMC数据集（技术相对一致，突出“同平台合并”场景）；另一组是供体匹配的iPSC数据（同时包含10X与Smart-seq2，突出“跨技术整合”难题）。在iPSC组中还通过将Smart-seq2供体再拆分成不同子集，模拟更小规模队列递增合并的真实联盟扩展过程，用于检验随着增加小型数据集，权重敏感性是否发生结构变化。
通俗地讲，这项工作像是在搭建一套“信息加权放大器”：不同实验室各自手里的单细胞数据音量大小、噪声底噪不同，直接把声音叠加会糊成一片；研究团队先测量每支麦克风（数据集）的特性，再给每路信号设定一个动态均衡权值，让清晰度最高的频段在汇总后占到应有权重，同时避免某些低质量或极低深度数据“过度发声”拉高假阳性。最后输出的是一张更干净的“细胞类型特异遗传调控”频谱图，为疾病关联变异解释提供更精准坐标。
4 冷冻肾脏也能精准“发声”——新型单核分离技术让肾髓质细胞全面呈现
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文章：Nuclei Isolation fromAdultMouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing
链接：https://app./t/62901/nuclei-isolation-from-adult-mouse-kidney-for-single-nucleus-rna
传统的酶解方法常常让肾皮质细胞“唱主角”，而肾髓质等区域的细胞则被严重低估，甚至在样本处理过程中产生大量应激相关的转录噪音，影响数据真实性。更令人头疼的是，这些方法还要求用新鲜组织，极大限制了样本的获取和储存。研究团队开发出一套简单高效的标准化流程，能够从冷冻保存的成年小鼠肾脏中切取中段薄片，直接分离出高质量细胞核用于snRNA-seq。这一流程全程在4℃低温环境下进行，完全避免了蛋白酶消化，最大程度减少了应激反应和背景干扰。研究者将肾脏切片控制在2毫米厚、20毫克以内，确保缓冲液充足并降低环境RNA污染，进一步提升数据的准确性。
它的核心思路主要就是：一是空间取材策略——不是整肾随意切，而是切取贯穿皮质—外髓—内髓的中段薄片，再适度修剪侧缘，降低皮质体积优势；二是全程低温+不使用常规蛋白酶消化，仅依赖机械温和匀浆与核裂解缓冲体系，阻断热/酶刺激引发的转录重编程；三是允许先经 RNA 稳定溶液处理后冷冻保存，突破“必须立即解离”的物流瓶颈，使存档或批量累积样本进入同一检测窗口成为可能。作者在操作层面对影响背景噪音的关键点给出量化约束：组织切片厚度不超过约 2 mm、重量不超过 20 mg，以保证裂解缓冲比例充足、降低游离环境 RNA（ambient RNA）贡献；全程器材与溶液预冷、避免剧烈涡旋或打泡以保护核膜完整；采用含 BSA 的低蛋白吸附体系与后续梯度/过滤与（可选）FACS 筛除碎片和双核，提升测序有效度。
与传统方法相比，这项技术显著提升了肾髓质细胞的检出率，让原本容易被忽略的髓质细胞“发声”更强烈。数据分析显示，髓质相关细胞类型的比例明显增加，皮质细胞的过度代表现象得到有效纠正，肾脏各区域细胞类型分布更加均衡。同时，应激相关基因的异常表达大幅减少，保证了测序结果更贴近真实的生理状态。更值得一提的是，该流程允许样本经过RNA稳定溶液处理后长期冷冻保存，大大扩展了样本类型和实验设计的灵活性，使得归档样本和大规模队列研究成为可能。
这项技术不仅为肾脏转录组研究提供了更真实、全面的数据基础，也为疾病模型、遗传调控和药物响应等后续研究提供了更坚实的平台。未来，如果进一步结合空间转录组、环境RNA定量等新技术，或针对特殊病理状态做优化，这一方案有望成为肾脏单核测序领域的标准操作流程。
5 SWIFT-seq无创技术为骨髓瘤检测提供新选择
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文章：SWIFT-seq enables comprehensive single-cell transcriptomic profiling of circulating tumor cells in multiple myeloma and its precursors
链接：https://www./articles/s43018-025-01006-0
多发性骨髓瘤是一种起源于骨髓的恶性肿瘤，常常由单克隆免疫球蛋白增多症（MGUS）或惰性骨髓瘤（SMM）逐步发展而来。长期以来，医生只能依靠骨髓活检来判断病情和监测遗传变化。然而，这种传统方法不仅操作复杂、痛苦，还存在检测灵敏度低、受限于样本部位等问题，导致很多患者的风险评估和治疗决策难以做到精准。
研究纳入101名患者与健康供体，覆盖MGUS、SMM与新诊断多发性骨髓瘤群体。SWIFT-seq在整体患者中可于约九成样本检测到循环肿瘤细胞，尤其在需要精细风险再分层的惰性骨髓瘤（SMM）与新诊断MM人群中，检出率分别达到约95%与94%。这种高检出能力为此前依靠单次骨髓部位采样可能遗漏的肿瘤异质性提供了补充窗口。
研究者强调，技术不只是“看到有没有肿瘤细胞”，而是将数量、基因异常、功能状态与预后关联表达模式整合于一次血检中，形成真正可操作的“多维监测画像”。相比依赖生物标志物面板的流式方法，基于分子指纹的枚举策略减少了因表型可塑性或标志表达下调导致的漏检风险。团队还报告构建了一个与“循环能力”相关的基因特征集合（签名），提示某些肿瘤细胞具备更强进入和存活于血流环境的能力，为解释既往骨髓瘤播散、生长不均与病程差异中的“未解之处”提供初步分子线索。
SWIFT-seq的出现，意味着骨髓瘤患者有望摆脱反复骨髓穿刺的痛苦，获得更加便捷、高效的疾病监测方式。未来，随着技术的不断完善和应用推广，SWIFT-seq有望成为骨髓瘤及相关血液肿瘤诊断的新标准，为患者带来更长远的健康福祉，也将推动肿瘤生物学研究迈向更深层次。