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想发高分文章，要么思路太“卷”，要么热点太“新”，不知从何下手？今天，就为你介绍一条高分捷径——聚焦新兴的“乳酸化”修饰。这不仅是前沿热点，更妙的是，它有一套“生信预测（机器学习）+实验验证”的黄金组合拳，形成了一套可复刻的干湿结合模板。近期发表在 Frontiers in Immunology (IF: 7.3) 上的一篇膀胱癌研究，就完美演绎了这套打法，通过机器学习锁定了关键调控基因FASN和RUNX2，并结合单细胞和实验进行了验证。想知道这个模板如何助你稳定产出5分+文章吗？我们为你完整拆解！ 
利用从 TCGA 数据库获得的基因表达数据集，作者分析了膀胱癌（BLCA）患者和健康对照。差异表达分析显示，BLCA 患者中存在 984 个上调基因和 1653 个下调基因（ Figures 1A, B）。功能注释和 Gene Ontology（GO）分析突出了“肌动蛋白结合”、“糖胺聚糖结合”和“细胞外基质结构成分”在 BLCA 发病机制中的显著作用（ Figure 1C）。此外，KEGG 通路分析确定了与 BLCA 发展相关的关键通路，包括“细胞粘附分子”、“PI3K-Akt 信号通路”和“MAPK 信号通路”（ Figure 1D）。
BLCA 患者的整体表达谱。(A) 方差火山图分析；(B) 显示 BLCA 与正常组织间差异表达的 Top 20 基因的熱圖；(C) GO 功能聚类分析；(D) KEGG 功能聚类分析。
在获得基因表达谱后，作者分析了 125 个与酰化相关的基因的表达和差异模式。其中，42 个基因在膀胱癌（BLCA）患者中显著上调，而 5 个基因显著下调 ( Figures 2A, B, Supplementary Figures 1A, B)。对这些 47 个差异表达基因（DEGs）的功能分析揭示了它们在关键生物过程中的作用。基因本体（GO）分析表明“核小体组装”、“蛋白质-DNA 复合物组装”和“蛋白质异源二聚化活性”存在显著变化，突出了表观遗传调控在 BLCA 中的关键作用 ( Figure 2C)。此外，KEGG 通路分析确定了“中性粒细胞胞外陷阱形成”、“ATP 依赖性染色质重塑”和“坏死性凋亡”等通路存在显著变化，这些通路都与癌症中的表观遗传调控和免疫调节密切相关 ( Figure 2D)。最后，作者绘制了这 42 个差异表达酰化相关基因的相互作用网络，为进一步研究它们在 BLCA 中的分子机制奠定了基础 ( Figure 2E)。
乳酰化相关基因的表达特征。(A) 与乳酰化相关的上调基因；(B) 与乳酰化相关的下调基因；(C) GO 功能聚类分析；(D) KEGG 功能聚类分析；(E) 47 个上调和下调乳酰化相关基因的相互作用和功能分析。
为了客观识别乳酰化相关基因中的核心基因，作者对 42 个差异表达基因进行了 LASSO 回归分析，将候选基因缩小到 19 个 ( Figure 3A, Supplementary Figure 2A)。随后，作者利用随机森林分析和支持向量机-递归特征消除 (SVM-RFE) 对乳酰化相关基因进行排序，确定了排名前 20 的基因 ( Figures 3B, C, Supplementary Figures 2B, C)。通过整合这三种方法的结果，作者最终确定了六个核心乳酰化相关核心基因：H2AC11、H3C6、H2AC16、RUNX2、AKR1B10 和 FASN ( Figures 3D, E)。
与乳酰化相关的核心基因鉴定。(A) LASSO 回归筛选 19 个基因； (B) 基于重要性通过随机森林识别 20 个基因； (C) 通过支持向量机 SVM 筛选 13 个基因； (D) 三种方法结果的交集鉴定出六个核心基因； (E) 六个核心基因的相关性分析，红色表示正相关，绿色表示负相关。
鉴定这些核心基因不仅为膀胱癌的诊断提供了潜在的生物标志物，也为进一步探索乳酰化在肿瘤发生中的作用奠定了基础。
通过对膀胱癌（BLCA）患者中六个核心基因进行全基因组相关性分析和基因集富集分析（GSEA），作者确定了它们在代谢、免疫调节和癌症相关通路中的关键作用。具体而言，AKR1B10 的表达与细胞色素 P450 酶代谢呈正相关，而与神经活性配体-受体相互作用通路呈负相关 ( Figure 4A)。FASN 的表达与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和造血细胞谱系通路呈正相关，但与寄生虫感染相关通路和自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性呈负相关 ( Figure 4B)。H2AC11 的表达与氧化还原代谢（如抗坏血酸和卟啉代谢）呈正相关，而与解毒酶和免疫相关通路呈负调节 ( Figure 4C)。H2AC16 的表达与 MAPK 信号通路和酪氨酸代谢呈显著正相关，但与药物代谢和免疫紊乱相关通路呈负相关 ( Figure 4D)。 H3C6 表达与细胞质 DNA 传感、RIG-I 样受体信号通路和 Toll 样受体信号通路呈正相关，而与系统性红斑狼疮和自噬调控通路呈负相关（ Figure 4E）。最后，RUNX2 表达与细胞因子-细胞因子受体相互作用、焦点粘附和癌症相关通路呈正相关，但与黑色素瘤和 NK 细胞介导的细胞毒性通路呈负相关（ Figure 4F）。这些发现突出了这些核心基因在 BLCA 发病机制中的多样化功能作用，为深入探索其分子机制奠定了坚实基础。
BLCA 患者中核心基因的功能分析。核心基因表达与 KEGG 通路的相关性。基于与(A) AKR1B10、(B) FASN、(C) H2AC11、(D) H2AC16、(E) H3C6 和 (F) RUNX2 的相关性分析结果，对 KEGG 进行 GSEA 分析（前 5 名）。
3.5. 核心基因的表达与膀胱癌患者的免疫学特征相关
作者比较了肿瘤组织与正常组织中的免疫细胞浸润量。结果表明，膀胱癌患者的 23 种免疫细胞类型中有 9 种浸润水平显著增加（ Figures 5A, B）。RUNX2 表达与六种免疫细胞的浸润水平呈显著负相关，而与巨噬细胞、中性粒细胞和记忆性 CD4+ T 细胞呈正相关。H3C6 的表达与调节性 T 细胞的浸润呈正相关，而与 M2 巨噬细胞和活化记忆性 CD4+ T 细胞呈负相关。此外，H2AC16 和 H2AC11 的表达与巨噬细胞和静息 NK 细胞的浸润呈正相关，而与静息树突状细胞、静息肥大细胞和调节性 T 细胞呈负相关。FASN 表达与树突状细胞活化呈强正相关，而 AKR1B10 表达则仅与幼稚 B 细胞浸润呈显著负相关（ Figure 5C）。数据显示，在膀胱癌中，核心基因表达与免疫细胞浸润模式之间存在紧密联系，突显了它们在调节肿瘤免疫微环境方面的潜在作用。
核心基因的表达与膀胱癌患者的免疫学特征相关。(A) 免疫细胞浸润的相关性；(B) 膀胱癌与正常对照组之间免疫细胞浸润的差异；(C) 免疫细胞浸润与六个核心基因之间的相关性。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns, 无统计学意义。
3.6. 利用 scRNA-seq 数据在 BLCA 患者中鉴定出 24 个细胞簇
对膀胱癌患者的 scRNA-seq 数据（GSE222315 ）( Supplementary Figures 3A–C）进行质量控制和标准化后， Figure 6A中展示了前 25 个基因。随后通过统一流形近似和投影（UMAP）进行降维，将细胞分类为 24 个离散簇（ Figures 6B, C）。采用“SingleR”函数进行细胞注释，识别并分类出八种细胞类型：T 细胞、B 细胞、NK 细胞、髓系细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和浆细胞（ Figure 6D）。进行差异表达分析以鉴定每种细胞类型的标志基因（ Figure 6E）。这些发现为 BLCA 中的细胞异质性提供了详细图谱，为后续研究膀胱癌中的细胞特异性过程奠定了基础。
使用 scRNA-seq 数据在 BLCA 患者中鉴定出 24 个细胞簇。(A) 前 30 个基因的表达情况；(B) 显示不同分辨率下细胞分组的聚类树状图；(C) 展示 24 个不同细胞簇的 UMAP 图；(D) 显示 9 种细胞类型中前标记基因表达的点图；(E) 每个簇中差异表达的前 3 个基因。
3.7. scRNA-seq 分析验证了乳酰化在膀胱癌免疫相互作用中的作用
作者通过检查 42 个乳酰化相关基因在多个细胞类型中的单细胞水平表达谱来评估膀胱癌中的乳酰化水平（ Figure 7A）。结果表明上皮细胞、T 细胞和浆细胞中的乳酰化评分升高，而髓系细胞、成纤维细胞和内皮细胞中的评分降低（ Figure 7B）。随后根据中位数乳酰化评分将细胞分为高乳酰化和低乳酰化组（ Figure 7C）。进一步检查发现上皮细胞、NK 细胞和浆细胞的乳酰化水平升高，而 B 细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和髓系细胞的乳酰化水平相对较低（ Figure 7D）。
scRNA-seq 分析验证了乳酰化在膀胱癌（BLCA）免疫相互作用中的作用。(A) 使用 R 包 GSVA 基于乳酰化基因集对单个细胞进行评分，显示不同细胞类型中评分的分布；(B, C) 乳酰化基因集评分的 UMAP 表示，根据中位数分为高和低水平；(D) 高和低乳酰化基因集评分组中每种细胞类型的数量和百分比；(E) 膀胱癌组织和正常组织之间乳酰化基因评分的比较；(F-I) 不同细胞类型中乳酰化基因评分的变化。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, ns, 无统计学意义。
最终，细胞根据其来源被分为肿瘤组织或非肿瘤组织。研究结果表明，与非肿瘤组织相比，肿瘤组织中的乳酰化水平显著升高（Figure 7E）。此外，包括 B 细胞、内皮细胞、成纤维细胞和浆细胞在内的几种细胞类型，在肿瘤组织中的乳酰化水平相对于其非肿瘤对应物显著增加（ Figures 7F–I）。这些发现突出了乳酰化在促进 BLCA 肿瘤微环境中的免疫相互作用方面的潜在功能。
3.8. 功能聚类分析识别浸润免疫细胞中的关键通路
为阐明与入侵免疫细胞相关的关键通路，作者基于 MSigDB 数据集使用 R 包 GSVA 对单个细胞进行评分，并分析了不同细胞类型的 HALLMARK 通路评分。结果表明，成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞之间存在强烈的通路富集一致性，其中大多数通路呈负相关，除外“APICAL_SURFACE”、“BILE_ACID_METABOLISM”、“KRAS_SIGNALING_DN”和“SPERMATOGENESIS”等通路。相比之下，其余六种免疫细胞类型（尤其是 T 细胞、NK 细胞和 B 细胞）在大多数通路中显示出主要为强烈的正相关 ( Figure 8)。
功能聚类分析确定了浸润免疫细胞中的关键通路。每个细胞根据 MsigDB 数据库中的 HALLMARK 通路被分配了一个分数。
类似地，基于 KEGG 数据集的通路富集分析显示出可比的 GSVA 评分模式。成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞与大多数通路呈负相关，从而将它们与其他六种浸润性免疫细胞类型区分开来。值得注意的是，肥大细胞在多个通路中获得了最高的富集分数，例如“丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢”、“α-亚麻酸代谢”和“花生四烯酸代谢”（Supplementary Figure 4）。
对 PID 数据集的分析进一步支持了 GSVA 评分中观察到的通路富集模式。成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞始终显示出相似的通路富集，其中大多数通路呈负相关，除了特定的通路，如“ALPHA_SYNUCLEIN_PATHWAY”、“BETA_CATENIN_DEG_PATHWAY”、“FGF_PATHWAY”和“IL23_PATHWAY”。相反，其余六种免疫细胞类型，尤其是 T 细胞、NK 细胞和 B 细胞，在大多数通路中表现出强烈的正相关 (Supplementary Figure 5)。
3.9. FASN 和 RUNX2 促进 BLCA 细胞的增殖并抑制其凋亡
作者随后研究了正常膀胱上皮细胞和 BLCA 细胞系之间多个靶基因的差异表达。与正常尿路上皮细胞相比，AKR1B10 表达显著降低，而 FASN 和 RUNX2 在多个 BLCA 细胞系中显著上调（ Supplementary Figure 6A）。这些发现表明 FASN 和 RUNX2 可能在 BLCA 细胞中发挥更强的致癌作用。为了进一步验证它们的功能作用，作者探索了 FASN 和 RUNX2 对 BLCA 细胞增殖、存活和凋亡的影响。作者将针对 FASN 或 RUNX2 的小干扰 RNA（siRNA）以及非靶向对照 siRNA 瞬时转染 T24 和 EJ-138 细胞。通过 qRT-PCR 和 Western blotting 验证了敲低效率（ Supplementary Figures 6B–E）。随后，作者使用 EdU 掺入实验和集落形成实验评估细胞增殖。如图 Figures 9A–D和 Supplementary Figures 7A–D所示，与对照相比，沉默 FASN 或 RUNX2 显著损害了 BLCA 细胞的增殖能力。接下来，作者使用 PI 染色和流式细胞术评估了细胞活力和凋亡。 在敲低 FASN 或 RUNX2 后，作者观察到 BLCA 细胞中的凋亡显著增加，这表明这两种基因可能通过赋予抗凋亡优势来促进肿瘤生长（ Figures 9E–H， Supplementary Figures 7E-H）。总的来说，这些结果表明 FASN 和 RUNX2 在促进 BLCA 细胞的生长和存活中起着关键作用，突显了它们作为治疗靶点的潜力。
FASN 和 RUNX2 促进 BLCA 细胞的增殖并抑制其凋亡。(A-B) T24 和 EJ-138 细胞转染 siFASN(A) 或 siRUNX2(B) 后的 EdU 染色。绿色：EdU；蓝色：DAPI。(C-D) 转染 siFASN(C) 或 siRUNX2(D) 后的集落形成实验。(E-F) 转染 siFASN(E) 或 siRUNX2(F) 后的 PI 染色显示细胞死亡增加。(G-H) 转染 siFASN(G) 或 siRUNX2(H) 后使用 Annexin V-FITC/PI 染色进行凋亡的流式细胞术分析。所有实验均独立重复至少三次。标尺：100 μm。
3.10. 沉默 FASN 或 RUNX2 可抑制 BLCA 细胞内的乳酸和蛋白质乳酸化
尽管 FASN 和 RUNX2 在 Gene Ontology 中被注释为与乳酰化相关的基因，但它们在乳酸代谢和蛋白质乳酰化中的调控作用尚不明确。为研究潜在的上游功能，作者使用 TIMER2.0 数据库分析了它们与关键糖酵解酶的相关性。这两种基因均与 LDHA 和 PDK 家族成员（ Figures 10A–H）表现出中等至强共表达，提示它们参与乳酸生物合成。
FASN 和 RUNX2 调控膀胱癌（BLCA）细胞内的乳酸生成和蛋白质整体乳酸化。(A–H) 使用 TIMER2.0 数据库进行 FASN 或 RUNX2 与糖酵解相关基因（LDHA、PDK1、PDK2、PDK3）之间的 Spearman 相关性分析。 (I–J) 通过 L-乳酸比色法检测 EJ-138 和 T24 细胞中 FASN (I) 或 RUNX2 (J) 在 siRNA 介导的敲低后的细胞内乳酸水平。乳酸浓度相对于阴性对照组（siNC）进行标准化。 (K–L) EJ-138 和 T24 细胞在 FASN (K) 或 RUNX2 (L) 敲低后的蛋白质整体乳酸化的 Western blot 分析。使用抗乳酸赖氨酸抗体检测全乳酸化信号，以 GAPDH 作为加载对照。主要乳酸化条带出现在 40 kDa 附近。 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns, 无统计学意义。
为验证这一点，作者通过 siRNA 介导的 FASN 或 RUNX2 敲低，测量了 EJ-138 和 T24 BLCA 细胞内的乳酸水平。沉默任一基因都导致乳酸积累显著减少（ Figures 10I–J），表明它们在乳酸生成中起正向调控作用。
鉴于乳酸是蛋白质乳酸化的底物，作者进一步通过 Western blot 评估了整体乳酸化水平。FASN 或 RUNX2 的敲低显著降低了两种细胞系的泛乳酸化水平（ Figures 10K–L）。值得注意的是，乳酸化信号主要在 40 kDa 附近观察到，表明该范围内的特定蛋白质可能是 BLCA 细胞中乳酸化的主要靶点。
这些结果表明 FASN 和 RUNX2 通过促进乳酸生成来间接调节乳酸化。由于乳酸积累和蛋白质乳酸化均与肿瘤生长和免疫调节有关，这些基因可能通过代谢-表观遗传途径促进 BLCA 的进展。然而，需要进一步研究以确定被修饰的蛋白质，并阐明在此背景下的乳酸化的下游效应。
总结
综上所述，作者的研究结果提出了一种新的机制轴——以 FASN 和 RUNX2 为中心，将代谢酶与蛋白质乳酸化及下游的肿瘤促进过程联系起来。这些见解不仅扩展了作者对蛋白质乳酸化超越组蛋白修饰的理解，还为靶向代谢表观遗传通路在 BLCA 治疗中提供了理论依据。然而，这项研究存在局限性。尽管作者在体外观察到了显著效果，体内验证和乳酸化底物的蛋白质组学鉴定——尤其是那些接近 40 kDa 的底物——对于全面理解乳酸化在 BLCA 中的生物学作用至关重要。未来采用质谱技术和乳酸化特异性富集策略的研究将对于揭示这种修饰在肿瘤和免疫环境中的功能靶点和后果至关重要。
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