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随着靶向治疗在肺癌领域越来越普及，研究的越来越深入，与之相伴随的肿瘤基因检测也越来越受到病友们的重视。然而大部分的病友以往缺乏相关经验与知识，缺少全面了解基因检测的渠道。本文将从检测的意义、适应人群、检测技术以及检测样本等角度，一站式介绍基因检测相关知识。

肿瘤治疗中有几项关键指标常被作为药物临床试验疗效验证的主要或次要终点用以评估治疗方案（包括靶向、化疗以及免疫治疗）的疗效，包括ORR（客观有效率）、PFS（无进展生存期）、OS（总生存期）等。ORR通常代表用药人群中观测到病灶缩小的比例，ORR越高意味着患者使用该药物后肿瘤缩小的可能性越高；PFS通常指从接受治疗开始到疾病开始进展的时间，也就是通俗意义上的“耐药时间”，自然是越长越好；OS即总生存期，各位从字面意思也能理解。

借住这些量化指标，我们确认了靶向治疗相较于传统治疗的显著优势。以ALK阳性非小细胞肺癌为例，三代ALK-TKI洛拉替尼在CROWN研究中展现出惊人的临床获益，一线治疗的中位PFS突破5年，这一数据不仅远超化疗，一二代ALK-TKI也是难以企及。这种超长PFS的实现，完全依赖于药物与ALK融合靶点的精准匹配。

然而，若无相应靶点，盲目使用靶向药物反而可能导致更差的临床结局。CTONG0806研究数据就清楚地表明，对于无EGFR突变的患者，使用吉非替尼的中位PFS仅有1.6个月，显著低于化疗组的4.8个月，且疾病控制率仅为化疗组的一半。

显而易见，不同于传统疗效评估的事后验证，基因检测在靶向治疗方面具有前瞻性，可为其疗效预测提供科学依据。上述数据有力地印证了基因检测在靶向治疗决策中的关键作用——只有通过精准的分子诊断确认靶点，才能充分发挥靶向药物的疗效优势，避免因盲目用药而延误治疗时机。

我国现阶段上市的靶向药物可谓是琳琅满目，种类繁多。靶向药之所以名为“靶向”，是因其有对应的靶点，即驱动基因突变。不同的驱动基因有各自对应的靶向药。表1参照指南共识以及靶向药的适应症，将非小细胞肺癌主要的靶向药物按照靶点分类，可以看到主要分为9大常见靶点：EGFR、ALK、ROS1、MET、RET、BRAF、HER2、KRAS以及NTRK。尽管最新的NCCN指南中新增了NGR1融合以及FGFR两个靶点，但由于推荐级别、药物可及性等原因，必要性尚不如前面9大基因经典。

综合而言，非小细胞肺癌患者的必检基因主要为表1中的9大基因。

表1. 各靶点对应靶向药物

靶向药物虽然疗效可靠，使用方便，但终究要面临耐药的问题。我们以最常见的EGFR与ALK两大类患者为例，简单的学习一下靶向药物的耐药机制。

EGFR-TKI药物主要的耐药机制分为EGFR依赖型和非EGFR依赖型两大类。一代/二代EGFR-TKI最主要的耐药机制属于EGFR依赖型，即新增EGFR T790M突变，出现几率约50%，除此以外还有可能出现非EGFR依赖型突变，如新增MET扩增等，只是几率相对低一些，也有可能发生病理转化（转化成小细胞肺癌）；三代EGFR-TKI药物的耐药机制尽管相对复杂一些，但总体而言仍然为EGFR依赖型和非EGFR依赖型两大类，前者最常见的是新增EGFR C797S突变，后者则以MET扩增为代表，除此以外还有病理类型转化的可能。

至于ALK-TKI药物，其耐药机制同样分为ALK依赖型和非ALK依赖型两大类。ALK依赖型即指ALK基因在融合突变的基础上自身新出现的点突变，如大名鼎鼎的ALK G1202R等突变；非ALK依赖型即不再是ALK自身出现新突变位点，而是继发出现旁路激活，可能新增的基因突变种类繁多，其中也包括EGFR、MET、RET、BRAF等非小细胞肺癌常见驱动基因。

由EGFR与ALK药物耐药机制可以看到，尽管有一、二、三代多款药物，然而耐药机制多种多样，前代药物耐药后不一定有机会序贯后代药物，或者尝试联合其他靶向药物，需要根据耐药后的基因突变情况作为指导。

这提醒着我们耐药后仍需重新做基因检测以为后续治疗提供参考。

肺癌是一大类统称，指原发位置在肺部的癌种。从病理性质上，肺癌可以分为两大类，非小细胞肺癌与小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占85%。非小细胞肺癌又可以进一步细分为肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌以及神经内分泌瘤等等。

大多数靶向药的适应症都是批准用于XX基因突变阳性的非小细胞肺癌，而小细胞肺癌尚无明确靶点以及靶向药物。这意味着非小细胞肺癌患者有机会携带驱动基因突变并有使用靶向药物治疗的机会，而小细胞肺癌患者通常不必追求基因检测。

非小细胞肺癌的各种亚型携带驱动基因突变的概率有显著差异，肺腺癌最高，近60%的肺腺癌患者可能携带9大驱动基因之一，而肺鳞癌、大细胞肺癌等有驱动基因阳性的几率就要低得多，尤其肺鳞癌患者，因其大多与抽烟相关，烟龄越长其有驱动基因突变的可能性越低。

因此，刚确诊的非小细胞肺癌患者可以考虑做基因检测，其中肺腺癌患者强烈推荐，其他癌种酌情考虑，女性不吸烟的肺鳞癌患者也可尝试做基因检测。

除了刚确诊时的非小细胞肺癌患者需要基因检测以外，已经使用靶向药的患者因面临着耐药的窘境，且前文提及了靶向药物的耐药机制与基因相关，所以为确定耐药后是否可序贯使用后代药物或者联合其他靶向药，耐药患者重新做基因检测是必要的。

随着ADAURA研究、ALINA研究等靶向术后辅助研究的阳性结果公布，表明EGFR以及ALK阳性的患者在术后接受靶向辅助可能相较于术后化疗辅助有更大把握延长复发时间。因此，IB期及以后或者术后病理有高危因素需考虑术后辅助治疗的非小细胞肺癌患者可选择基因检测，根据检测结果判断是否可选择术后靶向辅助治疗。

基因突变只是一个统称，包含有点突变、融合/重排、扩增、插入等突变类型。

点突变：指只有一个碱基对发生改变。广义点突变可以是碱基替换，单碱基插入或碱基缺失；狭义点突变也称作单碱基替换（base substitution）。我们将各个基因想象成列车，碱基就是车厢里的座位，缺少或者多了一个座位，亦或是原本是软座变成硬座，都叫做点突变。

融合/重排：简单而言就是两个不同基因的外显子间发生断裂，且相互融合成新的组合。使用列车作比，就是某节车厢断裂并且与其他班次的列车车厢相接变成一个新的列车。

扩增：某一个特定基因的拷贝数选择性地增加而其它基因的拷贝数并未按比例增加的过程。再用列车举例，即原本只有一列的列车发生意外变成了两列、三列乃至更多，超出正常范围自然就是异常。

FISH技术：即荧光原位杂交，是一种利用特异性荧光探针在荧光显微镜下检测目标DNA的检测技术，被认为是融合、扩增检测的金标准，部分三甲医院病理科即可开展。FISH检测需要特定的探针才可检测，一次只能检测一种基因扩增或者融合，且FISH检测只可使用组织样本。

PCR技术：全称聚合酶链式反应，其发明者因此在1993年获得诺贝尔化学奖，是20世纪非常重要的一项生物技术发明。PCR技术在病友口中往往被误传为“一代测序”或者“一代技术”，其实这是错误的，PCR和测序并不是一回事。PCR的原理是利用一对特异性的引物针对性将待检测的目标基因序列上的特定区域复制重复，若该基因携带有想检测的突变类型，则将被扩增复制，结果就是阳性；若无想检测的突变，则不会扩增，结果就是阴性。PCR技术通过不同的引物设计达到检测不同基因的目的。

NGS技术：即Next-generation sequencing（下一代测序），同时也被叫做高通量测序，它才是相较于一代测序（Sanger测序）的第二代技术，也正是因此而被称为二代测序。NGS在一代测序的基础上提升了精度以及检测通量，可以更多更好的进行检测任务。不同厂家的二代测序仪设计略有不同，但实验步骤大体都可以概括为：1、样本制备；2、文库构建；3、测序反应；4、数据分析。测序技术最大的特点就是将目标序列从头到尾的ATCG碱基对排列全部检测出来，然后在与数据库内的正确序列对比以检查目标序列是否发生突变，理论上无论是缺失、插入、扩增还是融合等突变类型都可检出，相当于挨家挨户查户口。

FISH、PCR以及NGS技术的原理、侧重点各有不同。FISH、PCR各有各的不足，如FISH检测只能单基因检测且只适用组织样本，而PCR技术虽然可适用多种样本，但其检测通量有限，有可能漏检扩增突变。NGS相对而言则比较均衡，检测精度与PCR接近，可适用多种样本，一次性可覆盖多个基因和多种突变类型。

9大驱动基因中ALK、ROS1、RET以及NTRK四个基因需发生融合突变才可使用靶向治疗，因此关于融合突变的检测十分重要。FISH、PCR以及NGS三种检测技术均可检测融合突变，但前两种检测技术均有局限，FISH以及PCR只可检测已知的常规融合类型，超出固定范围外的融合配体就无能为力了。

综合而言，NGS技术是相对理想的融合突变检测方法，可兼顾不错的检出率以及常规和罕见融合类型，并且可使用组织、体液样本。基因检测的检测对象通常为DNA，包括NGS技术也不例外。DNA虽然是携带遗传信息的最基本物质，但恰恰是由于这个特性，DNA内含诸多冗余信息以保证遗传信息稳定。DNA大多由内含子、外显子以及连接外显子的序列构成，有意义的信息集中在外显子上。

DNA上携带的遗传信息需转录成RNA，再进一步由RNA翻译成蛋白质。RNA相较于DNA携带诸多冗余信息而言，会更加精简，基本由主要的外显子拼接组成。

大多数情况下，NGS的检测性能足以发现DNA样本中的融合突变，但由于内含子等冗余信息的存在，使得其存在漏检的可能。2019年Ryma Benayed等发表研究，对232例经DNA检测无驱动基因突变的患者重新提取RNA进行检测，结果发现有27例融合（包括10例ROS1融合、4例ALK融合、3例RET融合以及5例NRG1融合）^[1]。这一结果表明RNA比DNA更适合于融合突变的检测。

2023年，《基于RNA-based NGS检测非小细胞肺癌融合基因临床实践中国专家共识》与《非小细胞肺癌融合基因检测临床实践中国专家共识》先后发布，NCCN指南中也新增了关于RNA-based检测用于补充融合突变检测的建议。

综上所述，条件允许的患者可同时考虑DNA-based与RNA-based双检。另外需要注意的是，尽管RNA更适于融合突变的检测，但它的物理特性也更不稳定，常温下极易降解，提取难度较大，需用组织样本提取，几乎不采用体液标本提取。

图片来源：摄图网

基因检测的对象是DNA或者RNA，而它们是由患者的样本中提取得到。常用的基因检测样本有很多种，比如手术样本、穿刺样本、气管镜样本、胸水样本、血液样本以及脑脊液样本，前三种统称组织样本，而后三种则称为体液样本。

血液是最常用的体液样本，其内除了各种正常的血细胞外，还会含有循环肿瘤细胞（CTC）以及循环肿瘤DNA（ctDNA），这两者就是血液基因检测的理论基础。血液样本无法做病理评估，只能直接提取DNA，然而即便提取DNA质量符合要求，也难以保证其中有足够浓度的肿瘤DNA（可能大部分是正常的DNA），这也是造成血液存在假阴性的主要原因。

NCCN指南中估算血液检测的假阴性略大约在30%左右，即10个实际有突变阳性的患者用血检测的话，大概只能检测出7个。

胸水与脑脊液样本平常接触机会不多，在某些情况下也是可选择的检测样本，两者有共同点，也有区别。先说胸水样本，胸水样本在体液样本中有一个非常大的优势就是“量足够多”，放一次胸水基本都要几百甚至上千毫升，体量远超其他体液样本，这个特点也让它有了两种不同的检测方式。第一种是离心取沉淀，胸水样本可以先离心后收集细胞残渣等沉淀做成蜡块，然后在显微镜下观察行类似病理诊断的操作，确认是否含有肿瘤细胞，若含有肿瘤细胞则可考虑用胸水蜡块按照组织样本进行检测（若蜡块剩余不足，建议重新抽取胸水），若无肿瘤细胞则不考虑以上操作。

出现这种情况就要介绍胸水样本的第二种检测方式——取上清检测，这是一个退而求其次的办法，因为ctDNA（循环肿瘤DNA）可能存在于胸水中，就如同其会存在于血液中一样，所以用胸水上清检测从某种程度上来说相当于在用血液检测，不同之处在于一般血液检测只抽10ml，而胸水上清至少都有几十或上百毫升，体积增多略微增加了检测成功的机会。

脑脊液样本与胸水类似，也可以送检做细胞学病理，但不同于胸水量大，脑脊液一次抽取量控制在5ml左右较为合适。通常脑转移进展或者脑膜转移的患者才考虑选择脑脊液做基因检测。

尽管样本类型繁多，但它们对于基因检测的价值并不相等，根据是否能提前确定含有足够肿瘤细胞，它们的检测性能排序大致为组织样本>胸水样本>血液样本。脑脊液样本较为特殊，因为只有特定患者才会采用它检测，而这类患者难以获取其他样本，所以单独考虑。