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高 VEGFA 表达与低 VEGFA 表达组相比，生存率较低
鉴于 VEGFA 是一种已知的血管生成因子，而血管生成与转移相关，作者首先关注分析 VEGFA 表达与患者生存之间的关系。作者发现，在 METABRIC 队列中，VEGFA 高表达组患者的无病生存期（DFS）、疾病特异性生存期（DSS）和总生存期（OS）均显著降低，在 SCAN-B 队列中 OS 也显著降低（所有 P < 0.02）（ Fig. 1 ）。在 TCGA 队列中，VEGFA 表达与生存期无显著差异，这可能是由于样本量较小。总体分析一致表明，VEGFA 高表达患者的生存结局比低表达患者更差。这一发现与 VEGFA 促进血管生成和增强转移潜能的作用相符。
VEGFA 表达与生存的相关性。TCGA 和 METABRIC 中的无病生存期（DFS）、疾病特异性生存期（DSS）和总生存期（OS）的 Kaplan-Meier 曲线及对数秩 P 值，以及 SCAN-B 中的总生存期。使用中位数作为两个 VEGFA 表达组的截断值，低表达（蓝色）和高表达（红色）。VEGFA：血管内皮生长因子-A；SCAN-B：瑞典癌症组学分析网络-乳腺；METABRIC：乳腺癌分子分型国际联盟；TCGA：癌症基因组图谱。
VEGFA 表达与三阴性乳腺癌（TNBC）相关，但与美国癌症联合委员会（AJCC）分期无关
发现高 VEGFA 表达与较差的临床预后相关，这促使了进一步分析临床参数，如亚型和 AJCC 分期。研究发现高 VEGFA 表达与 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中的 TNBC 亚型有显著关联（所有 P < 0.001）（Fig. 2 ）。由于 TNBC 是更具侵袭性的乳腺癌亚型，这些结果表明高 VEGFA 表达与更具侵袭性的乳腺癌相关。有趣的是，在 METABRIC 和 SCAN-B 队列中，VEGFA 表达更高的乳腺癌淋巴结转移率较低（P = 0.001 和 P = 0.004，分别）。此外，高 VEGFA 表达与远处转移没有一致的关联。
VEGFA 表达与临床参数之间的关联。临床因素箱线图：按 VEGFA 表达情况在 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中展示亚型、分期、淋巴结转移和远处转移。ER：雌激素受体；HER2：人表皮生长因子受体 2；VEGFA：血管内皮生长因子-A；SCAN-B：瑞典癌症基因组分析网络-乳腺；METABRIC：乳腺癌分子分类国际联盟；TCGA：癌症基因组图谱。
细胞增殖也是癌症侵袭性的一个关键特征，因此研究 VEGFA 与突变率之间的关联以及与细胞增殖的关系引起了作者的兴趣。作者发现 VEGFA 与较高的诺丁汉组织学分级显著相关，并且在 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中，VEGFA 的表达与增殖标志物（Ki67 基因）的表达增加显著相关（所有 P < 0.001）（ Fig. 3a ）。VEGFA 在 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中始终富集所有标志性的细胞增殖相关基因集，包括 MYC 靶点 v1 和 v2、E2F 靶点、G2M 检查点、有丝分裂纺锤体和 mTorC1 信号通路（ Fig. 3b ）。在 TCGA 队列的进一步分析显示，高 VEGFA 表达与较高的沉默和非沉默突变率、HRD、肿瘤内异质性和 SNV 新抗原相关（ Fig. 3c ）。
VEGFA 与病理分级、突变率、新抗原和细胞增殖相关基因集的关联。(a) TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中病理分级和 Ki67 基因（MKI67）表达的箱线图。(b) 细胞增殖相关基因集的富集得分图：有丝分裂纺锤体、G2M 检查点、E2F 靶点、MYC 靶点 v1 和 v2 以及 MTORC1 信号通路，通过 GSEA 使用 NES（标准化富集得分）和 FDR（假发现率）在 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中进行分析。根据 GSEA 软件的建议，FDR < 0.25 定义为统计显著性。(c) TCGA 队列中同源重组缺陷（HRD）、肿瘤内异质性和突变相关得分的箱线图：沉默突变和非沉默突变率、单核苷酸变异（SNV）和 indel 新抗原。高、低 VEGFA 表达组由中位数截断确定。VEGFA：血管内皮生长因子-A；SCAN-B：瑞典癌症组学分析网络-乳腺；METABRIC：乳腺癌分子分类国际联盟；TCGA：癌症基因组图谱；GSEA：基因集富集分析；ITH：肿瘤内异质性。
为了了解 VEGFA 如何影响肿瘤微环境，作者研究了 VEGFA 表达与肿瘤微环境内免疫细胞浸润的关联。研究发现，VEGFA 与抗肿瘤免疫细胞（如 CD8 T 细胞、中央记忆细胞毒性 T 细胞（CD8 Tcm）、CD4 T 细胞、CD4 naive T 细胞、树突状细胞、B 细胞和 naive B 细胞）的低浸润相关，以及免疫细胞（如 1 型辅助性 T 细胞（Th1 细胞）、调节性 T 细胞、2 型辅助性 T 细胞和浆细胞（ Fig. 4 ））的高浸润。
VEGFA 表达与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润分数。箱线图显示了免疫细胞的浸润分数：CD8 T 细胞、CD8 Tcm 细胞、CD4 T 细胞、CD4 naive T 细胞、Th1 细胞、树突状细胞（DC）、调节性 T 细胞（Tregs）、Th2 细胞、B 细胞、naive B 细胞和浆细胞，这些数据来自 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列，根据中位数截断法确定的低 VEGFA 表达组和 high VEGFA 表达组。VEGFA：血管内皮生长因子-A；SCAN-B：瑞典癌症组学分析网络-乳腺；METABRIC：乳腺癌分子分类国际联盟；TCGA：癌症基因组图谱。
VEGFA 表达与血管生成相关数据相关，但与血管生成无关
由于 VEGFA 主要被视为血管生成因子，作者对调查 VEGFA 与血管生成之间的关系特别感兴趣。VEGFA 与周细胞高浸润存在关联，但出乎意料的是，它与血管生成基因集或内皮细胞、微血管内皮细胞（MVE）细胞、淋巴内皮细胞（LECs）的浸润没有显著关联（ Fig. 5 ）。
VEGFA 与血管生成及其相关数据的关联。(a) 血管生成相关细胞浸润分数的箱线图：在 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中的周细胞、内皮细胞、微血管内皮细胞（MVE）细胞和淋巴内皮细胞（LECs）。(b) 在 TCGA、METABRIC 和 SCAN-B 队列中，通过 GSEA 分析 VEGFA 高分组和低分组的血管生成基因集富集评分图。VEGFA：血管内皮生长因子-A；SCAN-B：瑞典癌症组学分析网络-乳腺；METABRIC：乳腺癌分子分类国际联盟；TCGA：癌症基因组图谱。
研究表明，VEGFA 水平高的患者对蒽环类药物和紫杉类药物为基础的化疗以及免疫疗法的反应更好
由于 VEGFA 始终与癌症侵袭性相关，作者有必要探索 VEGFA 表达与治疗反应之间的关系。在 ISPY2 队列中，VEGFA 表达高的 ER 阳性/HER2 阴性（ER+/HER2-）乳腺癌患者在使用 durvalumab/olaparib 免疫治疗时，其病理完全缓解（pCR）率显著高于 VEGFA 表达低的患者。这种免疫治疗与标准化疗组（ Fig. 6a ）相比，结果也显著更优。在 GSE25066 队列中，ER+/HER2-和三阴性乳腺癌（TNBC）患者使用蒽环类药物和紫杉类药物化疗时，VEGFA 表达高的患者 pCR 率也显著更高，这一结果得到了 GSE20194 、 GSE163882 和 GSE34138 队列数据趋势的支持（ Fig. 6b ）。为确保这些结果不受混杂因素影响，所有使用的队列均为新辅助队列。针对特定治疗的队列（如 ISPY2 和 GSE25066 ）则分别进行分析，以考虑治疗异质性。
VEGFA 与接受新辅助治疗的 pCR 患者的关系。(a) ISPY2 队列中免疫治疗（durvalumab/olaparib）组和标准化疗组的 VEGFA 表达与病理完全缓解（pCR）和残留疾病（RD）反应的箱线图。(b) 新辅助队列GSE25066 、 GSE20194 、 GSE163882 和 GSE34138 中蒽环类药物和紫杉类药物化疗的 VEGFA 表达与 pCR 和 RD 反应的箱线图。VEGFA：血管内皮生长因子-A；ER：雌激素受体；HER2：人表皮生长因子受体 2；TNBC：三阴性乳腺癌；NS：无显著差异。
总结
在乳腺癌中，高 VEGFA 表达与更侵袭性的疾病特征相关，包括细胞增殖增加、肿瘤微环境中免疫细胞浸润减少以及生存结果更差。然而，它也与蒽环类药物和紫杉类药物为基础的化疗以及免疫治疗的更好反应相关。这些发现表明，VEGFA 可以作为指导治疗选择的预测性生物标志物，以及识别预后不良患者的预后生物标志 。
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