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文章信息：Duan X Y, Song L, Jin Q, et al. Enhancing Cordycepin Biosynthesis in Yarrowia lipolytica via Lipid Droplets Compartmentalization Engineering and Optimized Fermentation Strategies[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025. (IF₂₀₂₄ 5.7)

研究团队：

Zhi Wang: College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, P. R. China

Yun Tian: College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, P. R. China

原文链接：https:///10.1021/acs.jafc.5c03654

研究要点

本文研究了如何通过脂滴区室化工程和优化发酵策略来增强解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中虫草素（cordycepin, COR）的异源生产。研究确认了CmCns1和CmCns2在脂滴上的共定位，并发现CmCns1通过与CmCns2的强相互作用将其从细胞质招募到脂滴上。基于此，研究者开发了一种工程菌株YL-CD3，通过扩大脂滴和CmCns3-NK的区室化来增加虫草素的产量。通过优化发酵参数，研究者在摇瓶中将虫草素的产量提高到2008.23 mg/L，并在2.4 L生物反应器中通过补料批培养实现了4780.75 mg/L的产量，这是迄今为止在解脂耶氏酵母中报道的最高产量。该研究建立了解脂耶氏酵母作为高效虫草素生物合成的高潜力平台。

脂滴区室化工程：通过鉴定CmCns1中的关键脂滴靶向基序，成功将CmCns2招募到脂滴上，并通过扩大脂滴和CmCns3-NK的区室化来增强虫草素的合成效率。

发酵策略优化：通过优化发酵条件（如温度、初始葡萄糖浓度、表面活性剂添加等），显著提高了虫草素的产量，最终在2.4 L生物反应器中实现了4780.75 mg/L的产量，这是迄今为止在解脂耶氏酵母中报道的最高水平。

高效生产平台的建立：将解脂耶氏酵母成功开发为虫草素生物合成的高潜力平台，为工业化生产提供了新的策略和思路。

亚细胞定位研究：首次在解脂耶氏酵母中研究了CmCns1和CmCns2的亚细胞定位，并揭示了其在脂滴上的共定位机制，为理解虫草素合成途径提供了重要基础。

前体物质补充策略：通过补充腺苷（ADO）和腺嘌呤（ADE）等前体物质，进一步提高了虫草素的产量，为代谢工程提供了新的思路。

图表解读

Figure 1: Subcellular localization of CmCns1 and CmCns2 in Y. lipolytica

CmCns1和CmCns2在解脂耶氏酵母中的亚细胞定位。

(A) CmCns1与绿色荧光蛋白（GFP）融合后定位于脂滴（LDs），通过Nile Red染色显示脂滴的位置。

(B) CmCns2与红色荧光蛋白（RFP）融合后主要分布在细胞质中。

(C) 当CmCns1和CmCns2共表达时，两者均定位于脂滴，表明CmCns1通过与CmCns2的强相互作用将其从细胞质招募到脂滴上。

CmCns1和CmCns2的共定位对于虫草素合成途径的区室化至关重要。

Figure 2: The characterization of truncated CmCns1

CmCns1的截短突变体的三维结构模型及其亚细胞定位。

(A) CmCns1的三维结构模型，分为两个结构域：Domain I（CmCns11−440）和Domain II（CmCns1441−792）。

(B) 不同截短突变体的亚细胞定位：

• CmCns11−440：定位于脂滴。

• CmCns1441−792：分布在细胞质中，未定位于脂滴。

• CmCns11−260 和 CmCns1261−440：均定位于脂滴，表明Domain I中存在多个脂滴锚定区域。

• CmCns1261−365：定位于细胞膜。

• CmCns1366−440：定位于脂滴。

CmCns1的脂滴定位主要依赖于其N端的440个氨基酸（Domain I），且可能存在双重定位（脂滴和细胞膜）的特性。

Figure 3: Increasing COR production by reforming the LDs

通过改造脂滴来提高虫草素产量的策略。

(A) 工程菌株中YlDGA1和YlDGA2过表达的示意图，用于增加脂滴的数量和大小。

(B) YL-GRD1和YL-GRD2菌株的荧光观察结果，显示脂滴的变化。

(C) 不同菌株在72小时发酵后的虫草素产量：

• YL-GR：对照菌株，产量为378.6 mg/L。

• YL-GRD1：过表达YlDGA1，产量提高到378.6 mg/L，比对照菌株提高了20.5%。

• YL-GRD2：过表达YlDGA2，产量降低到163.2 mg/L，比对照菌株降低了48.1%。

过表达YlDGA1可以显著增加虫草素产量，而过表达YlDGA2则导致产量下降，可能是因为YlDGA2过度积累脂质，分流了碳通量。

Figure 4: Enhancement of COR production via targeting CmCns3-NK toward LDs

将CmCns3-NK靶向脂滴以提高虫草素产量的策略。

(A) CmCns3-NK靶向脂滴的示意图，通过融合CmCns1的脂滴靶向序列（CmCns1366−440）实现。

(B) 不同菌株在72小时发酵后的虫草素产量：

• YL-CD1：未靶向脂滴的对照菌株。

• YL-CD2：表达胞质CmCns3-NK的菌株。

• YL-CD3：CmCns3-NK靶向脂滴的菌株，产量为1269.44 mg/L，比YL-CD2提高了2.96%。

(C) 前体物质（ADO和ADE）补充对虫草素合成的影响：补充1−4 g/L的ADO和ADE可以显著提高虫草素产量，其中2 g/L ADO补充后产量达到1864.47 mg/L。

将CmCns3-NK靶向脂滴可以提高虫草素产量，但效果有限，前体物质的补充可以进一步提高产量。

Figure 5: Improvement of COR production through fermentation engineering

通过发酵工程优化提高虫草素产量的实验结果。

(A) 温度对虫草素产量的影响：30 °C时产量最高（1236.84 mg/L）。

(B) 初始葡萄糖浓度对虫草素产量的影响：25 g/L葡萄糖时产量最高（1499.06 mg/L）。

(C) 金属离子（Fe² 、Zn² 、Mg² ）对虫草素产量的影响：添加这些金属离子会降低产量。

(D) 氨基酸（组氨酸、苏氨酸）对虫草素产量的影响：添加这些氨基酸会降低产量。

(E) 表面活性剂（Tween-80、Triton X-100、SDS）对虫草素产量的影响：Triton X-100显著提高了产量（1895.69 mg/L）。

(F) 在优化条件下（30 °C、25 g/L葡萄糖、0.4% Triton X-100）的虫草素产量：2008.23 mg/L。

通过优化发酵条件，特别是温度、初始葡萄糖浓度和表面活性剂的添加，可以显著提高虫草素的产量。

Figure 6: Fermentation of COR by strain YL-CD3 in a 2.4 L bioreactor

在2.4 L生物反应器中进行补料批培养的虫草素发酵结果。

发酵过程：在2.4 L生物反应器中，初始添加0.05% Triton X-100，每24小时补充10 g/L葡萄糖，共补充72 g/L葡萄糖。

结果：

• OD₆₀₀：在48小时达到峰值（46.65），随后逐渐下降。

• 虫草素产量：在144小时发酵后，产量达到4780.75 mg/L（150.1 mg/OD₆₀₀，66.57 mg/g葡萄糖）。

补料批培养显著提高了虫草素的产量，这是迄今为止在解脂耶氏酵母中报道的最高产量。

区室化工程的进一步优化：虽然本文成功将CmCns3-NK靶向脂滴，但仅通过单一靶向序列实现的产量提升有限（仅2.96%）。未来可以考虑将更多关键酶（如CmCns1、CmCns2）同时靶向脂滴或其他细胞器，以进一步提高合成效率。同时，细胞内的代谢环境是动态变化的，未来可以开发动态调控的区室化系统，例如通过诱导型启动子或传感器来控制酶在脂滴上的定位，以适应不同的发酵阶段。

前体物质供应的优化：本文通过补充腺苷（ADO）和腺嘌呤（ADE）显著提高了虫草素产量，但这种外源补充成本较高且效率有限。未来可以结合代谢通量分析（MFA），系统地优化前体物质的合成途径，减少碳通量的分流。同时，利用合成生物学工具对前体物质合成途径中的关键基因进行精细调控，提高前体物质的供应效率。

发酵过程的智能化控制：目前发酵过程的优化主要依赖于离线检测和经验调整。未来可以开发在线监测系统（如实时检测葡萄糖、虫草素浓度等），结合反馈调控策略，实现发酵过程的智能化控制。同时，除了温度、葡萄糖浓度和表面活性剂，还可以考虑其他发酵参数（如pH值、溶解氧、搅拌速度等）的协同优化，以进一步提高产量和转化效率。

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