大家好，今天跟大家分享一篇题为S100Pisa ferrop tosis suppressor to facilitatehe patocellula r carcinoma develo pment by rewiringli pidmeta bolism（S100P是一种铁下垂抑制剂，通过复卷脂代谢促进肝细胞癌的发生）铁死亡的主要机制是细胞膜中含多不饱和脂肪酸的磷脂(PUFA-PLs) 在富含铁和活性氧(ROS)的条件下易发生脂质过氧化，这种脂质过氧化物在细胞膜中的积累最终会破坏膜的完整性，从而诱导细胞死亡。
01
研究背景
铁死亡是一种新发现的由铁驱动的脂质过氧化诱导的程序性细胞死亡，被认为是一种潜在的肿瘤治疗方法。然而，新出现的证据表明，肝细胞癌 （HCC） 细胞通常对铁死亡具有抵抗力，并且其潜在的分子机制知之甚少。在这里，我们的研究证实，在铁死亡抗性 HCC 细胞中显着上调的 S100 钙结合蛋白 P （S100P） 有效抑制铁死亡。
从机制上讲，S100P 促进乙酰辅酶 A 羧化酶 α （ACC1） 的溶酶体降解，这对于脂质的从头生物合成是必不可少的。S100P 的缺失会提高 ACC1 的表达并促进 HCC 细胞的铁死亡敏感性。S100P 介导的 ACC1 降解依赖于 RAB5C，RAB5C 通过 P62 依赖性选择性自噬将 ACC1 引导至溶酶体。
敲除 RAB5C 或 P62 消除了 S100P 诱导的 ACC1 溶酶体降解，并恢复了 HCC 细胞对铁死亡的抵抗力。我们的工作揭示了另一种抗铁死亡途径，并表明 S100P 是 HCC 铁死亡相关治疗的有前途的成药靶点。
见图一
S100P 与肝癌的铁死亡耐药性呈正相关。
图一
a 在指定浓度的 RSL3 处理 12 小时后，使用 CCK-8 对一组 HCC 细胞系（HuH7、HepG2、Hep3B、Li7、SNU387）进行铁死亡评估。
b 用 RSL3 （200 nM） 和 fer-1 （2 μM） 处理 6 小时的 HuH7 和 SNU387 细胞死亡。死细胞用 Sytox Green 染色。
c 用 RSL3 （200 nM） 和脂-1 （2 μM） 处理 3 小时的 HuH7 和 SNU387 细胞的脂质过氧化测量。
e 用 RSL3 （2 μM） 处理的 HuH7 细胞和用 RSL3 （200 nM） 处理的 SNU387 细胞中 PTGS2 和 S100P 的相对 mRNA 水平在指定时间内。
f 用 RSL3 （1 μM） 处理的 HuH7 细胞的 S100P 表达指定时间。
g 用 erastin （5 μM） 处理指定时间的 HuH7 细胞的 S100P 表达。Western blot 实验独立重复 3 次，f 和 g 结果相似。数据和误差线是 s.d. ±平均值，n = 3 个 a-c 和 e 中的生物独立实验。使用 b、c 和 e 中的双尾学生 t 检验计算 P 值。源数据作为 源数据 文件提供。
见图二
PGK1 通过 S271 位点的磷酸化与 NLRP3 相互作用。
图二
a、c表达 sg-ctrl 和 sg-S100P 的 HuH7 或 HepG2 细胞的蛋白质印迹分析。
B、D来自 a 或 c 的 HuH7 或 HepG2 细胞的细胞死亡，用 RSL3 （2 μM） 和 fer-1 （2 μM） 处理 6 小时。
e 用 RSL3 （2 μM） 和利普罗-1 （2 μM） 处理 3 小时的 HuH7 和 S100P KO 细胞的脂质过氧化 F S100P 在异位表达 S100P 的 Huh7 S100P KO 细胞中 S100P 表达的蛋白质印迹分析。
g 用 RSL3 （2 μM） 和 fer-1 （2 μM） 处理 f 的 Huh7 细胞死亡 6 小时。转染 S100P 的 SNU387 细胞的 Western blot 分析。
i 来源于经 RSL3 （200 nM） 和 fer-1 （2 μM） 处理 6 小时的 h 衍生的 SNU387 细胞的细胞死亡 j 过表达 S100P 的 SNU387 细胞的细胞死亡测定，用 erastin （2 μM） 和 fer-1 （2 μM） 处理 24 小时。
k 来自 HuH7 和 S100P KO 细胞的 3D 球状体的代表性图像，经 IKE （5 μM） 和 lipro-1 （2 μM） 处理 48 小时。比例尺，10 μm。
l 通过 Sytox 绿色阳性区域可视化的 3D 球状体细胞死亡。m 用 RSL3 （2 μM） 处理 6 小时的贴壁和分离细胞（在 HuH7 细胞中构建的失巢凋亡模型）的细胞死亡。
n 用 RSL3 （1 μM） 处理指定时间的 HuH7 贴壁和分离细胞中 S100P 表达的蛋白质印迹分析。
o 用 RSL3 （2 μM） 处理 6 小时的 HuH7 和 S100P KO 细胞的 Anoikis 模型构建。比例尺，10 μm。p 在用 RSL3 （2 μM） 处理 6 小时的 HuH7 和 S100P KO 细胞中构建的失巢凋亡模型。
见图三
S100P 抵抗独立于 RAGE 和经典铁死亡基因的铁死亡。
图三
a 用指定浓度的色甘酸钠预处理 SNU387 S100P OE 细胞 12 小时，然后用 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。
b 用指定浓度的色甘酸钠预处理 12 小时，然后用 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时的 HT1080 S100P OE 细胞的细胞活力。
d 表达 sg-ctrl 或 sg-RAGE 的 SNU387 S100P OE 细胞的细胞死亡测量，用 RSL3 （100 nM） 处理 6 小时。表达 sg-ctrl 和 sg-RAGE 的 HT1080 S100P OE 细胞的蛋白质印迹分析。
f 表达 sg-ctrl 或 sg-RAGE 的 HT1080 S100P OE 细胞在 RSL3 （100 nM） 处理 6 小时后进行细胞死亡测量 HuH7 和 S100P KO 细胞中经典铁死亡相关基因的 Western blot 分析。
h HepG2 和 sg-S100P 细胞中经典铁死亡相关基因的 Western blot 分析。
i SNU387 和 S100P OE 细胞中经典铁死亡相关基因的蛋白质印迹分析。
h HT1080 和 S100P OE 细胞中经典铁死亡相关基因的 Western blot 分析。Western blot 实验独立重复 3 次，在 c、e 和 g-j 中得到相似的结果。数据和误差线是 s.d. ±平均值，n = 3 个 a、b、d 和 f 中的生物独立实验。使用 d 和 f 中的双尾 Student’s t 检验进行统计分析。源数据作为 源数据 文件提供。
见图四
S100P 通过溶酶体依赖性方式降解 ACC1。
图四
a HuH7 WT 和 S100P KO 细胞中的脂质代谢组学分析表明 S100P 抑制 PUFA 的含量。
b HuH7 WT 和 S100P KO 细胞中的磷脂酰乙醇胺 （PE） 含量。
c HuH7 WT 和 S100P KO 细胞中脂质合成或摄取基因的蛋白质印迹分析。
d 表达 sg-ctrl 或 sg-S100P 的 HepG2 细胞中脂质合成或摄取的基因的 Western blot 分析。
e SNU387 细胞和 S100P OE 细胞中脂质合成或摄取的基因的 Western blot 分析。
f HT1080 细胞和 S100P OE 细胞中脂质合成或摄取的基因的蛋白质印迹分析。
g 用 RSL3 （1 μM） 处理指定时间的 HuH7 细胞中的 Western 印迹分析。
h 用 erastin （5 μM） 处理指定时间的 HuH7 细胞中的蛋白质印迹分析。
i 对转染指定剂量的 S100P 的 HEK293T 细胞进行蛋白质印迹分析，以检测 ACC1 表达。
j 对转染 S100P 的 HEK293T 细胞进行 Western blot 分析，以检测 CHX 处理后 ACC1。
k 显示了 ACC1 的带灰度密度的定量数据。
l 用氯喹 （CQ） 和 MG132 处理的 SNU387 S100P OE 细胞的蛋白质印迹分析表明，CQ 而不是 MG132 可以挽救 S100P 对 ACC1 的下调。m Bailomycin A1 处理后 SNU387 S100P OE 细胞的 Western blot 分析。Western blot 实验独立重复 3 次，c-j 和 l、m 的结果相似。数据和误差线是 b 中 s.d. 的平均值± n = 4（S100P KO 组）和 n = 3（WT 组）生物独立实验。n = 3 个 K 中的生物独立实验。使用双尾 Student’s t 检验进行统计分析。源数据作为 源数据 文件提供。
见图五
P62 和 RAB5C 对 S100P 介导的 ACC1 降解至关重要。
图五
a ACC1 和 S100P 之间相互作用的外源性免疫沉淀测定。通过抗 Flag 抗体进行 IP 检测。
b ACC1 和 S100P 之间相互作用的外源性免疫沉淀测定。通过抗 GFP 抗体进行 IP 测定。
c ACC1 和 S100P 在 HT1080 细胞中共定位的共聚焦显微镜测定。细胞核用 DAPI （蓝色） 染色，ACC1 （绿色） 和 S100P （红色） 的共定位在合并的面板中显示为黄色荧光。比例尺，20 μm。
d S100P（绿色卡通）和 ACC1（粉色卡通）之间相互作用的视图。
e 用于查找 S100P 结合蛋白的 IP-MS 策略37.f 外源性 S100P 和内源性 RAB5C 结合的免疫沉淀分析。通过抗 Flag 抗体进行 IP 检测。
g 外源性 S100P、ACC1 和内源性 RAB5C 结合复合物的免疫沉淀分析。通过抗 Flag 抗体进行 IP 检测。
h ACC1、S100P 和 RAB5C 之间相互作用的免疫沉淀分析。通过抗 ACC1 抗体进行 IP 检测。
i 在 S100P OE 细胞中进行蛋白质印迹分析，以检测敲除 RAB5C 后 ACC1 的蛋白水平。
j 表达 sg-ctrl 或 sg-RAB5C 的 S100P OE 细胞在 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时后进行细胞死亡测量 ACC1 和 P62 之间相互作用的外源免疫沉淀测定。将 HA-P62 、 Falg-ACC1 和 HA-S100P 质粒转染到 HEK293T 细胞中。通过抗 Flag 抗体进行 IP 检测。
l 对过表达 S100P 的 HEK293T 细胞进行 Western blot 分析，检测敲除 P62 后 ACC1 的蛋白水平。Western blot 实验独立重复 3 次，在 a、b、f-i 和 k、l 中得到相似的结果。数据和误差线是 SD ±平均值，n = 3 个 j 生物独立实验。使用双尾 Student’s t 检验进行统计分析。源数据作为 源数据 文件提供。
见图六
S100P-ACC1 轴是调节铁死亡敏感性的替代途径。
图六
a 用 PF-05175157 （50 nM） 预处理 12 小时，然后用 RSL3 （2 μM） 处理 6 小时的 HuH7 WT 和 S100P KO 细胞的细胞死亡测量 b 用 PF-05175157 （50 nM） 预处理 12 小时，然后用 RSL3 （2 μM） 处理 6 小时的 SNU387 和 S100P OE 细胞的细胞死亡测量然后 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。
d 用 PF-05175157 （100 nM） 预处理 12 小时的 HT1080 和 S100P OE 细胞的细胞死亡测量，然后 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。
e 表达 sg-ctrl 和 sg-ACC1 的 HuH7 的 S100P KO 细胞中的 Western blot 分析。
f 表达 sg-ctrl 或用 RSL3 （2 μM） 处理 sg-ACC1 的 HuH7 KO 细胞的细胞死亡测量 6 小时。表达 sg-ctrl 和 sg-ACC1 的 SNU387 细胞的蛋白质印迹分析。
h 表达 sg-ctrl 或 sg-ACC1 的 SNU387 细胞的细胞活力测定，用 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。i 表达 sg-ctrl 或 sg-ACC1 的 SNU387 细胞的细胞死亡测量，用 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。
j 表达 sg-ACC1 的 HT1080 细胞的蛋白质印迹分析。
k 表达 sg-ctrl 或 sg-ACC1 的 HT1080 细胞的细胞活力测定，用 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。
l 表达 sg-ctrl 或 sg-ACC1 的 HT1080 细胞的细胞死亡测量，用 RSL3 （200 nM） 处理 6 小时。敲除 ACC1 后，用 RSL3 （1 μM） 和利普罗-1 （2 μM） 处理 6 小时的 S100P KO 细胞的脂质过氧化测量.Western blot 实验独立重复 3 次，在 e、g 和 j 中得到相似的结果。数据和误差线是 s.d. ±平均值，n = 3 个 a-d、f、h、i 和 k-m 的生物独立实验。使用双尾 Student’s t 检验进行统计分析。源数据作为 源数据 文件提供。
02
研究结论
HCC 是全球高度异质性的恶性肿瘤之一，全球发病率迅速增加。尽管多学科治疗策略发展迅速，但 HCC 患者的总生存率仍然很差。越来越多的证据表明，HCC 细胞很容易通过重新连接代谢过程或改变表观遗传特征来产生对多种疗法的耐药性，从而导致治疗失败。
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