大家好，今天跟大家分享一篇题为PGK1phos phorylates NLRP3and mediate sinflam masome activationin dependent ofitsgly colytic activity（PGK1磷酸化NLRP3并介导炎症小体激活，与糖酵解活性无关）的研究论文。本研究发现 PGK1 可不依赖其糖酵解功能直接调控 NLRP3 炎症小体激活。
01
研究背景
糖酵解是炎症反应的关键参与者。磷酸甘油酸激酶 1 （PGK1） 是糖酵解途径中的一种必需酶。然而，人们对它在炎症反应中的作用知之甚少。在这项研究中，我们报道了 PGK1 作为一种激酶，它通过非糖酵解功能响应脂多糖 （LPS） 刺激而直接调节 NLRP3 炎性小体激活。
我们鉴定了 PGK1 在 S271 位点的新型磷酸化修饰，由蛋白激酶 CK2 介导。重要的是，S271 位点的磷酸化作为激活 PGK1 激酶功能的分子开关，激活它以磷酸化 NLRP3。这种 PGK1 介导的 NLRP3 在 S448/S449 位点的磷酸化随后募集 USP14 以促进 NLRP3 去泛素化，从而促进 NLRP3 炎性小体激活。
使用 PGK1S271A/S271A 系列转基因小鼠模型，我们进一步证明阻断 S271 磷酸化对 LPS 诱导的内毒素血症和明矾诱导的腹膜炎具有显着保护作用。我们的研究结果揭示了 PGK1 在炎症中的新调节作用，并为 NLRP3 驱动的疾病提供了潜在的治疗策略。
见图一
PGK1 缺陷减轻全身和腹膜炎症并损害 NLRP3 炎性小体活化。
图一
（A） PGK1 的存活曲线FL/FL、PGK1mKO小鼠 （n = 10 只小鼠/组） 在腹膜内注射 LPS 后 （8 mg/kg）。
（B 和 C）LPS 注射后 6 小时的血清 IL-1β （B） 和 TNF-α （C） 水平 （每组 n = 5）。
（D） PGK1 腹膜 CD11bLy6G 细胞 （中性粒细胞） 的流式细胞术分析++FL/FL、PGK1MKO小鼠腹腔注射明矾后 12 小时（每组 n = 5）。
（E） LPS 引发的 BMDM （PGK1FL/FL、PGK1mKO） 用黑菌素处理;探测细胞裂解物 （Lysate） 和上清液 （SN） 的 NLRP3 通路成分。
（F-H）ELISA 定量上清液中 IL-1β （F）、TNF-α （G） 和 LDH 释放 （H）。
见图二
PGK1 通过 S271 位点的磷酸化与 NLRP3 相互作用。
图二
（A） 使用指定抗体在 HEK293T 裂解物中对 HA-PGK1 和 FLAG-NLRP3 进行免疫共沉淀 （coIP）。
（B） LPS 引发的 BMDM 未刺激或用黑牙菌素刺激 30 分钟。细胞裂解物进行 IP 并用指定的抗体进行免疫印迹。
（C） 黑牙菌素± BMDM 中 PGK1（绿色）和 NLRP3（红色）的免疫荧光。比例尺：10 μm。
（D-F）使用截断突变体对 PGK1-NLRP3 相互作用进行结构域映射。
（G） PGK1 的进化保守性 （267 − 276）。
（H 和 I）PGK1 磷酸化突变体和 NLRP3 结合的 CoIP 分析。PGK1（3K/R） 是指 PGK1 （267–276） 中残基 K256、K258 和 K260 的赖氨酸-精氨酸突变。
（J） 预测 NLRP3 上的潜在关键氨基酸，这些氨基酸决定了与被 271 个丝氨酸磷酸化的 PGK1 的相互作用。
见图三
PGK1 S271 磷酸化增强 NLRP3 炎性小体活性。
图三
（A） LPS/nigericin 处理的 WT 和 PGK1 的免疫印迹S271A/S271A 系列BMDM 的。
（B） LPS 刺激 BMDM 0 、 8 和 16 小时，如图所示通过免疫荧光分析它们 （黄色箭头）。比例尺，10 μm。
（C） WT 和 PGK1 中的 ASC 寡聚化S271A/S271A 系列BMDM 的。
（D） ASC 斑点（白色箭头）的定量。比例尺：20 μm。
（东至半）LPS 引发的 BMDM （WT， PGK1S271A/S271A 系列） 用 LPS 处理 4 小时，然后用尼日利亚菌素或 MCC950（一种 NLRP3 抑制剂，10 μΜ）刺激，如图所示，细胞裂解物 （Lysate） 和培养上清液 （SN） 的免疫印迹分析，以及上清液中 LDH 释放 （F）、IL-1β 分泌 （G） 和 TNF-α 分泌 （H） 的 ELISA 测定。
（I） PGK1 肽（10aa WT 和 10aa S271D）与细胞穿透性 TAT 肽偶联。
（J） 用 LPS/nigericin 处理的 LPS 引发的 BMDM，用肽（10aa WT 或 10aa S271D）、细胞裂解物 （Lysate） 和培养上清液 （SN） 的免疫印迹分析如图所示。
见图四
CK2 介导的 PGK1 S271 磷酸化驱动 NLRP3 激活。
图四
（A） PGK1 的氨基酸序列 267 至 276 在多个物种中是保守的，并且包含 CK2 的识别基序。
（B） Myc-CK2 与 GST-PGK1/S271A 的体外激酶测定。用转染 Myc-CK2 的 293T 细胞的抗 Myc 免疫沉淀 Myc-CK2，并与 20 μL 纯化的 GST-PGK1 和 GST-PGK1S271A 蛋白、50 μM ATP、10× 激酶测定缓冲液和 1× 蛋白酶抑制剂混合物在 30°C 下孵育 30 分钟，如图所示通过抗体免疫印迹分析。
（C） 用指定的载体转染 HEK293T 个细胞。用抗 FLAG 抗体对样品进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹分析。
（D） 用指定的载体转染HEK293T细胞，并用或不用 TBB （5 μM） 处理。用抗 FLAG 抗体对样品进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹分析。
（E） LPS 引发的 WT 和 PGK1S271A/S271A 系列用尼日利亚菌素 （45 min） ± TBB （5 μM） 刺激 BMDMs;指定蛋白质的细胞裂解物 （Lysate） 的免疫印迹分析。
（F-H）ELISA 定量上清液中 IL-1β （F）、TNF-α （G） 和 LDH 释放 （H）。
（I 和 J）来自 WT 和 PGK1 的 BMDMS271A/S271A 系列小鼠用 LPS 处理 4 和 16 h。使用 XF24 Seahorse 分析仪测量细胞外酸化和耗氧率。底部条形图分别显示最大糖酵解能力和最大呼吸能力。
见图五
PGK1 在 S448/449 位点磷酸化 NLRP3 以调节泛素化。
图五
（A） HA-PGK1 与 FLAG-NLRP3 在 HEK293T 裂解物中的 CoIP;使用指定抗体进行免疫印迹。
（B） NLRP3 残基 436-457 和 1,010-1,024 在不同物种中的序列比对。
（C） 表达 Myc-NLRP3、FLAG-NLRP3 （WT、S448A/449A、S1016A） 和 HA-泛素的 HEK293T 细胞中的泛素化测定;用抗 FLAG 免疫沉淀的裂解物。
（D） 与 Myc-泛素共表达的 FLAG-NLRP3 （WT， S448A， S449A） 的泛素化分析;使用指定抗体进行免疫印迹。
（E） HA-PGK1 与 FLAG-NLRP3 （WT， S448A/449A） 在 HEK293T 细胞中的 CoIP。用抗 FLAG 抗体对样品进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹分析。
（F） LPS 引发的 PM（WT、NLRP3S448A/449A、NLRP3S448D/449D）处理 LPS 4 小时，然后用黑牙菌素刺激。如图所示，对细胞裂解物 （Lysate） 和培养上清液 （SN） 进行免疫印迹分析。
（G-I）上清液中 LDH （G）、IL-1β （H） 和 TNF-α （I） 的 ELISA 定量。
见图六
PGK1 通过 USP14 促进 NLRP3 去泛素化。
图六
（A） 转染指定构建体的 HEK293T 细胞中 NLRP3 的泛素化分析;如图所示，使用抗 FLAG 抗体和免疫印迹进行 IP。
（B） 用 LPS （200 ng/mL， 4 h） 引发并用 WP1130 （0， 2.5， 5 μM， 30 min） 处理的 BMDMs。对细胞裂解物进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹分析。
（C） 使用抗 FLAG 抗体对 HEK293T 裂解物中 Myc-NLRP3、FLAG-USP14 和 HA-PGK1 的 CoIP，并如图所示通过免疫印迹分析。
（D） 用指定的载体转染 HEK293T 细胞，用抗 HA 抗体免疫沉淀样品，并如图所示通过免疫印迹分析。
（E） PGK1FL/FL和 PGK1mKO用 LPS 引发 BMDM 4 小时，用抗 NLRP3 免疫沉淀细胞裂解物，并如图所示通过免疫印迹分析。
（F） 基于计算建模预测的 USP14 和磷酸化 NLRP3 （p-S448/p-S449） 之间的相互作用界面。
（G） 用指定的载体转染 HEK293T 个细胞。用抗 FLAG 抗体对样品进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹分析。
（H） 用用载体或 TBB 处理的指定载体转染 HEK293T 个细胞。用抗 Myc 抗体对样品进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹进行分析。
（I） 用指定的载体转染 HEK293T 个细胞。用抗 FLAG 抗体对样品进行免疫沉淀，并如图所示通过免疫印迹分析。
02
研究结论
总之，我们的工作将 PGK1 确定为 NLPR3 炎性小体激活的关键激酶依赖性增强子。CK2-PGK1-NLRP3-USP14 信号轴为 NLRP3 驱动的病理提供了新的治疗靶点。未来的研究将侧重于开发特异性阻断其 NLRP3 结合界面的选择性 PGK1 抑制剂，并探索该信号通路的组织特异性调节。
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