大家好，今天跟大家分享一篇题为HBO1 catalyzes lysine lactylation and mediates histone H3K9la to regulate gene transcription（HBO1催化赖氨酸乳酸化并介导组蛋白H3K9la调节基因转录）近年来，代谢与表观遗传调控之间的相互作用成为生命科学领域的研究热点。乳酸作为葡萄糖代谢的终产物，长期以来被认为是在缺氧条件下产生的废物，具有有害作用。
01
研究背景
赖氨酸乳酸化（Kla）连接代谢和基因调控，在多种生物过程中起关键作用。然而，Kla的调控机制和功能后果仍有待探索。在这里，我们报道了HBO1作为赖氨酸乳酸转移酶调节转录的功能。我们表明，HBO1在体外和细胞内催化Kla的添加，E508是HBO1乳酸转移酶活性的关键位点。
定量蛋白质组学分析进一步揭示了HBO1靶向的95个内源性Kla位点，其中大多数位于组蛋白上。使用位点特异性抗体，我们发现HBO1可能优先催化组蛋白H3K9la，包括JADE1和BRPF2在内的支架蛋白可以促进组蛋白Kla的酶活性。值得注意的是，CUT&Tag 测定表明 HBO1 是转录起始位点 （TSS） 上的组蛋白 H3K9la 所必需的。
此外，受调节的 Kla 可以促进关键信号通路和肿瘤发生，这通过评估 HBO1 敲除 （KO） 肿瘤细胞的恶性行为以及临床组织中组蛋白 H3K9la 的水平得到进一步支持。我们的研究表明，HBO1 作为乳酸转移酶介导组蛋白 Kla 依赖性基因转录。
见图一HBO1调节细胞内赖氨酸乳基化。
图一
a 分别与 la-CoA 形成的 HBO1、MOF、Tip60 和 MOZ 复合物的预测结构。蛋白质用带状显示，结合配体用球棒状结构显示。分子对接表明，HBO1与la-CoA的亲和常数高于其他因子。
b 免疫荧光（IF）染色显示，外源过表达野生型p300和HBO1可提高HeLa细胞的乳酸化水平，而过表达HBO1（E508Q）不能。刻度，20 μm。
c， d 蛋白质印迹分析显示HEK293T细胞中的 HBO1 而非 HBO1 （E508Q） 增加了组蛋白乳酸化水平 （c）。过表达p300作为阳性对照（d）。
e 条形图显示了HBO1敲低后HBO1基因的相对mRNA表达水平。所有数据（平均值 ± SD，双尾学生 t 检验）均来自三个生物学重复 （n = 3）。P 值如图所示。p < 0.0001 （****）。
f 蛋白质印迹分析显示，基于慢病毒的shRNA短暂敲低HBO1导致HeLa细胞中组蛋白乳酸化的下调。g， h HBO1 蛋白的敲除 （KO） 导致组蛋白乳酸水平下调。慢病毒感染后48 h获得HBO1敲除的混合克隆细胞。从41个克隆细胞中筛选出2个稳定的克隆细胞。所有免疫印迹和免疫荧光染色均有3次生物学重复，结果相似。
见图二
HBO1在体外直接催化乳基化。
图二
a， b HBO1 代替 HBO1 （E508Q） 在体外增强了组蛋白的乳酸化水平。HBO1和HBO1（E508Q）在HEK293T细胞中过表达，并使用抗Flag M2珠进行亲和纯化。将纯化后的蛋白质与la-CoA（a）或ac-CoA（b）一起孵育，并从HEK293T中提取组蛋白作为体外组蛋白酰化测定的反应底物。
c， d HBO1 在体外对重组蛋白 H3/H4 的乳基化具有催化活性，但对 HBO1 （E508Q） 没有催化活性。HBO1或HBO1（E508Q）分别与乳酰辅酶A（c）或乙酰辅酶A（d）和重组蛋白H3/H4作为反应底物孵育，进行体外酰化测定。
e， f HBO1 （336-611） 催化组蛋白的乳酸化修饰水平呈酶剂量依赖性 （e） 和反应时间依赖性 （f） 的特征。HBO1 （336-611） 是从大肠杆菌中纯化的。反应时间点：10、30 和 60 分钟。酶的作用是：0.5、1.5 和 2.5 μg。
g， h 重组HBO1（336-611）分别与乳酰辅酶A（e）和乙酰辅酶A（f）的亲和力的等温滴定量热法（ITC）分析。所有免疫印迹和等温滴定量热法 （ITC） 分析都有 3 次生物学重复，结果相似。源数据以源数据文件的形式提供。
见图三
HBO1内源性Kla底物的鉴定。
图三
a 直方图显示了用于分析乳酸化的样品的实验确定的相对蛋白质丰度分布。
b 散点图显示HBO1-KO HeLa细胞中Kla肽与宽型HeLa细胞的比率（通过蛋白质丰度归一化）。
c HBO1敲除后下调乳基化蛋白的GO分析。使用过度表示检验计算 FDR 的 GO 项富集，以进行多重测试校正。选择 p 值临界值 = 0.05 和 q 值临界值 = 0.1 作为临界标准。Benjamini 和 Hochberg 校正用于调整 p 值。
d 在 HeLa 细胞中鉴定的由 HBO1 调节的组蛋白 Kla 位点的图示。
e H3K9la肽（K（la）STGGK（ac）APR）的代表性MS/MS谱图）。
见图四
HBO1调控组蛋白乳酸化位点的特征。
图四
a–c 混合克隆 （a） 和稳定克隆 （b） 中 HBO1 敲除后各种组蛋白乳酸化位点的变化以及基于慢病毒的 shRNA 敲低 HBO1 （c） 的蛋白质印迹分析。
d Western blotting结果显示，HBO1-KO细胞中HBO1-WT代替HBO1（E508Q）的重表达可以挽救组蛋白乳酸化水平。
e， f Western blotting 分析显示，全球组蛋白和各种组蛋白位点中乳酸化水平的下调与 WM-3835 的剂量和时间相关。WM-3835：HBO1 的特异性抑制剂。
g 组蛋白的乳酸化是由 HBO1 介导的乳酸依赖性。分别额外添加 0 mM 或 20 mM 乳酸钠刺激 HeLa 细胞和 HBO1-KO HeLa 细胞。所有免疫印迹都有三个生物学重复，结果相似。源数据以源数据文件的形式提供。
见图五
支架蛋白在细胞内和体外促进HBO1乳基转移酶能力。
图五
a-c 基于慢病毒的shRNA瞬时敲低JADE1（a）或BRPE2（c）或单独HBO1和HBO1-JADE1复合物（b）过表达后组蛋白乳酸化的蛋白质印迹分析。
d-g 支架蛋白增强 HBO1 在体外组蛋白乳酸化的催化活性。通过抗Flag M2珠的免疫亲和力从HEK293T细胞中纯化Flag-HBO1、Flag-HBO1-JADE1或Flag-HBO1-BRPF2复合物，分别与la-CoA（d，f）和ac-CoA（e，g）孵育，用于体外组蛋白酰化测定。 所有免疫印迹都有三个生物学重复，结果相似。源数据以源数据文件的形式提供。
见图六
HBO1和H3K9la转录后果的基因组分析。
图六
a 维恩图显示了 HeLa 细胞中 HBO1 和 H3K9la 峰的共定位分析。
b 饼图显示，HBO1和H3K9la共定位的11524个峰中，有42.7%位于TSS区域3 kb范围内。
c 通过CUT&Tag数据分析生成的热图说明了TSS区域中HBO1和H3K9la在±3 kb范围内的共处峰。
d 饼图显示，HeLa和HBO1-KO细胞中49.2%的差异富集峰在TSS区重叠，其中68.0%在TSS区分布在±3 kb以内。
e 通过deepTools可视化的H3K9la的结合密度：热图显示H3K9la的差异结合峰分布在HeLa和HBO1-KO细胞的TSS区域±3 kb范围内。
f CUT&Tag的代表性痕迹显示，H3K9la富集在AQP1、LAMC2和F10基因的TSS区。红色和蓝色轨迹分别代表WT和HBO1-KO细胞富集的峰值。
g 通过qPCR验证AQP1、LAMC2和F10基因的CUT&Tag结果（n = 3次生物学重复）。
h RT-qPCR分析显示HeLa和HBO1-KO细胞中AQP1、LAMC2和F10基因的转录水平（n = 3次生物学重复）。
i，j细胞克隆形成测定和transwell侵袭测定分别显示HBO1敲除后HeLa细胞的增殖（i）和侵袭能力（j）（Scale，50μm）（n = 3次生物重复）。 在组织微阵列中采用免疫组化（IHC）检测kHBO1表达和H3K9la水平。显示了 IHC 的典型图像。刻度，50 μm。l 宫颈肿瘤H3K9la水平和HBO1表达水平显著高于正常宫颈组织（宫颈癌患者n=84，正常n=52）。数据以平均值±标准差、双尾学生 t 检验的形式呈现。P 值如图所示。源数据以源数据文件的形式提供。
02
研究结论
综上所述，我们报道HBO1是一种乳酸转移酶，通过催化组蛋白H3K9la介导基因转录。我们的结果支持了组蛋白乳酸化可以在表观遗传调控和可能的其他生物过程中发挥关键作用的新主题。
大量研究证明，组蛋白酰化失调可能导致包括癌症在内的各种疾病36,37,38.对调节酶的不断扩展的知识对于揭示新发现的 PTM 在生理学和病理学中的作用至关重要，为药物治疗提供了潜在的靶点。
我们的研究提供了令人信服的证据，表明 HBO1 在 TSSs 区域高度富集并有助于组蛋白乳酸化，表明 HBO1 介导的 H3K9la 可能激活编码肿瘤发生的基因的转录。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。