大家好，今天跟大家分享一篇题为Non-canonical lysosomal lipolysis drives mobili zation of adipose tissue energy stores with fasting（非规范溶酶体脂解驱动禁食时脂肪组织能量储存的动员）人体对禁食的生理适应使其能在长时间不进食的情况下存活，这一过程涉及的分子通路可能是模型生物中饮食限制产生延寿效应的关键驱动因素。
01
研究背景
对禁食的生理适应使人类能够在没有食物的情况下长时间存活，并涉及可能驱动模式生物饮食限制延长生命作用的分子途径。经典中性脂肪酶（包括限速脂肪甘油三酯脂肪酶 （Pnpla2/ATGL）从脂肪细胞脂质储存中动员脂肪酸和甘油，对于适应性禁食反应至关重要。
在这里，我们发现了一种涉及溶酶体程序的脂肪细胞脂肪分解的替代机制。我们在小鼠、小鼠和人脂肪细胞以及脂肪组织外植体培养物中采用药理学和遗传学方法对溶酶体脂肪分解进行了功能测试，确定了对溶酶体酸性脂肪酶 （LIPA/LAL） 和小眼症/转录因子 E （MiT/TFE） 家族的依赖性。
我们的研究建立了一个模型，其中经典途径对于在禁食急性期对肾上腺素能刺激的快速脂肪分解反应至关重要，而替代溶酶体途径在长时间禁食中占主导地位。
见图一禁食驱动小鼠脂肪组织中的溶酶体程序。
图一
a 禁食诱导脂肪分解的小鼠模型。小鼠禁食24小时并再饲喂6小时（C57Bl6雄性n = 5;雌性小鼠n = 6续，6只禁食，5只重复，8周龄）。通过单因素方差分析/Tukey 检验评估统计显着性。左：男性血清甘油：*p = 0.03;男性血清非酯化脂肪酸 （NEFA）：****p < 0.0001。右：女性甘油：***p = 0.0001，**p = 0.007;NEFA：****p < 0.0001。当存在误差线时，表示 s.d.m. （a）。
b 用于经典脂肪酶 （ATGL）、溶酶体转录调节因子（TFEB、TFE3、MITF）和溶酶体脂肪酶 （LAL） 的腹股沟 （iWAT） 和性腺 （gWAT） 脂肪组织免疫印迹。对照、禁食、再喂养方案与“a”相同。注意：微管蛋白对照在不同的凝胶上运行。
c 从腹股沟脂肪组织中分离的脂肪细胞的 qPCR，包括经典脂肪分解基因和溶酶体基因。男性 n = 6 个 con，5 个禁食，6 个 refed;女性 n = 6 con，6 fast，5 refed：*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001，双向方差分析/邓内特检验。对照、禁食、再喂养方案与“a”相同。
d 将分离的脂肪细胞（来自 C）与源自原代脂肪细胞祖细胞 （AP） 细胞（n = 3 个生物重复）或 3T3L1 细胞（n = 3 个生物重复）的营养限制性脂肪细胞培养物进行比较的热图。
e. 脂肪组织中溶酶体标志物 （LAMP1） 的全贴片免疫荧光染色。箭头=假定的 LAMP1+ 点表示溶酶体。LD=脂滴。N = 原子核。刻度 = 10 微米。N = 5 对照，7 以这种方式禁食染色并用于盲法计数，如“f”所示。
f 盲法观察者计算外脂+脂肪细胞中的核周LAMP1+点点：n = 5对照，7禁食;双侧 T 检验;误差线 S.D.M. g 通过 ELISA 测量来自分离脂肪细胞的溶酶体制剂中的外皮脂水平。在喂食小鼠的溶酶体制剂中未检测到外利脂素;因此，测定的下限（0.055 ng / mL）用于图表的目的。每个点代表一只小鼠，n = 8，通过双尾 t 检验评估显着性;误差线 SDM
见图二
非典型溶酶体脂肪分解机制在长时间禁食时发挥作用。
图二
a-b 脂肪细胞特异性ATGL/Pnpla2功能丧失（KO）相对于对照（FLOX）的示意图，使用研究开始时8-9周龄的小鼠。配对抽血用于评估对肾上腺素能刺激（异丙肾上腺素）和禁食的脂肪分解反应。对于面板 d-h，数据显示为平均值，SDM b 异丙肾上腺素 （ISO） 或快速血浆 NEFA 的变化。通过双因素方差分析评估基因型效应的显着性。FLOX 男性 n = 5;KO 男性 n = 7;FLOX 女性 n = 5 与 iso 和 n = 6 与禁食;KO 女性 n = 7。
c 异丙肾上腺素 （ISO） 或快速改变血浆甘油。通过双因素方差分析评估基因型效应的显着性。FLOX 男性 n = 5;FLOX 女性 n = 5;KO 男性 n = 7;KO 女性 n = 6。
d 通过双尾 t 检验评估的体重变化：FLOX 男性 n = 6;FLOX 女性 n = 5;KO 男性 n = 7;KO 女性 n = 7。通过双尾 t 检验评估显着性。
e 终末血浆酮水平。FLOX 男性 n = 6;FLOX 女性 n = 5;KO 男性 n = 7;KO 女性 n = 6。通过双尾 t 检验评估显着性。
f 终末血浆 FGF21 水平。FLOX 男性 n = 5;FLOX 女性 n = 5;KO 男性 n = 7;KO 女性 n = 7。通过双尾 t 检验评估显着性。
g 终末血糖水平。FLOX 男性 n = 5;FLOX 女性 n = 5;KO 男性 n = 7;KO 女性 n = 6。通过双尾 t 检验评估显着性。分离腹股沟 （iWAT） 和性腺 （gWAT） 脂肪细胞的 h qPCR 用于脂肪分解和溶酶体基因。FLOX n = 10（男性 n = 5，女性 n = 5;KO n = 13（男性 n = 7;女性 n = 6）。双向方差分析，**p = 0.008;p = 0.0002;p < 0.0001。i 在 24 小时禁食时间点收集的 iWAT 和 gWAT 脂肪组织的免疫印迹。注意：微管蛋白对照在不同的凝胶上运行。
见图三
靶向脂肪细胞中溶酶体功能的转录调节因子可减弱长时间禁食的脂肪分解。
图三
a-b 他莫昔芬诱导的脂肪细胞特异性 Tfeb 功能丧失 （KO） 相对于对照组 （FLOX） 的示意图，使用研究开始时 8 周龄的小鼠。配对抽血用于评估对肾上腺素能刺激（异丙肾上腺素）和禁食的脂肪分解反应。对于面板 d 和 f-j，数据显示平均值，S.D.M.b。异丙肾上腺素 （ISO） 或快速血浆非酯化脂肪酸 （NEFA） 的变化：FLOX n = 9（6 名男性，3 名女性）;KO n = 13（7 名男性，6 名女性）。评估基因型效应的双向方差分析。
c 异丙肾上腺素 （ISO） 或快速改变血浆甘油。FLOX n = 9（6 名男性，3 名女性）;KO n = 13（7 名男性，6 名女性）。p < 0.0001，双向方差分析以评估基因型效应。
d 对照小鼠中分离的脂肪细胞（FLOX）或脂肪细胞特异性Tfeb功能丧失（KO）（n = 9 FLOX;n = 13 KO）的qPCR分析。评估基因型效应的双向方差分析。
e 在 24 小时禁食时间点收集的 LAL、TFEB 和 ATGL 性腺脂肪组织 （gWAT） 的免疫印迹。注意：微管蛋白对照在不同的凝胶上运行。
f 对对照小鼠（FLOX）或脂肪细胞特异性Tfeb功能丧失（KO）小鼠（n = 9 FLOX;n = 13 KO）分离脂肪细胞中葡萄糖代谢基因的qPCR分析。评估基因型效应的双向方差分析，*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。
g 对照小鼠终末血浆葡萄糖 （FLOX） 或脂肪细胞特异性 Tfeb 功能丧失 （KO）。FLOX n = 9（6 名男性，3 名女性）;KO n = 13（7 名男性，6 名女性）。通过双尾 t 检验评估显着性。
h 对照小鼠中的终末血浆酮（FLOX）或脂肪细胞特异性Tfeb功能丧失（KO）。FLOX n = 9（6 名男性，3 名女性）;KO n = 13（7 名男性，6 名女性）。通过双尾 t 检验评估显着性。i 体重变化。FLOX n = 9（6 名男性，3 名女性）;KO n = 13（7 名男性，6 名女性）。通过双尾 t 检验评估显着性。j 通过 ELISA 测量的终末血浆成纤维细胞生长因子 21 （FGF21） 水平：FLOX n = 9（6 名男性，3 名女性）。通过双尾 t 检验评估显着性。
见图四
禁食时脂肪细胞脂肪分解从ATGL依赖性脂肪分解到LAL依赖性脂肪分解的时间转变。
图四
a-b 通过靶向 Pnpla2 （b、d、e、h、i、l、m、p） 的 ATGL 功能丧失 （KO）;通过靶向 Lipa （c、f、g、j、k、n、o、q） 的 LAL 功能丧失 （KO）;每个都显示相对于对照 （FLOX）。对于面板 b-o，数据显示为平均值，S.D.M. b 异丙肾上腺素 （ISO） 刺激的非酯化脂肪酸 （NEFA）（左）和甘油（右）。FLOX n = 12（8 名男性，4 名女性）;KO n = 15（8 名男性，7 名女性）。对于 b–g：双因素方差分析，基因型效应。
c ISO 刺激的 NEFA（左）和甘油（右）。FLOX n = 19（9 名男性，10 名女性）;KO n = 18（10 名男性，8 名女性）。
d 体重随禁食而变化。FLOX n = 12（8 名男性，4 名女性）;KO n = 13（8 名男性，5 名女性）。
e 血浆葡萄糖随禁食而变化。FLOX n = 12（8 名男性，4 名女性）;KO n = 13（8 名男性，5 名女性）。
f 体重随着禁食而变化。FLOX n = 19（9 名男性，10 名女性）;KO n = 18（10 名男性，8 名女性）。
g 血浆葡萄糖随禁食而变化。FLOX n = 19（9 名男性，10 名女性）;KO n = 18（10 名男性，8 名女性）。
h 末端血浆酮。FLOX n = 12（8 名男性，4 名女性）;KO n = 13（8 名男性，5 名女性）。对于 h-k，通过双尾 t 检验评估显着性。i 终末肝甘油三酯。FLOX n = 12（8 名男性，4 名女性）;KO n = 13（8 名男性，5 名女性）。j 末端血浆酮。FLOX n = 19（9 名男性，10 名女性）;KO n = 18（10 名男性，8 名女性）。
k 终末肝甘油三酯。FLOX n = 19（9 名男性，10 名女性）;KO n = 18（10 名男性，8 名女性）。l 来自ATGL KO（n = 12）或对照（n = 13）的腹股沟（iWAT）脂肪细胞的qPCR。对于 l–o 双向方差分析：*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。性腺 （gWAT） 脂肪细胞的 m qPCR：ATGL KO （n = 12） 或 FLOX （n = 13）。腹股沟脂肪细胞的n qPCR：LIPA KO（n = 12）或FLOX（n = 12）。
o 性腺脂肪细胞的 qPCR：LIPA KO （n = 12） 或 FLOX （n = 12）。
p 来自对照或脂肪细胞特异性ATGL功能丧失（KO）小鼠的腹股沟和性腺脂肪组织的免疫印迹;24 小时禁食时间点。q 来自对照或LIPA功能丧失（KO）小鼠的腹股沟和性腺脂肪组织的免疫印迹;24 小时禁食时间点。p，q 注意：微管蛋白对照在不同的凝胶上运行。
见图五
溶酶体依赖性脂肪分解在禁食时在人体脂肪组织中起作用。
图五
a 住院禁食 10 天期间皮下脂肪组织的人类转录组学分析相对于第 0 天的 MiT/TFE 因子倍数变化 （n = 7）。使用线性模型的差异表达，根据不包括时间因子 （∼1） 的简化模型进行似然比检验，并使用 Benjamin-Hochberg 多重检验校正。
b A 中 TFEC 倍数变化和 LIPA 倍数变化数据集之间的双侧 Spearman 相关性 （n = 7）。
c A 中 MITF 倍数变化和 LIPA 倍数变化数据集之间的双侧 Spearman 相关性 （n = 7）。
d 多西环素诱导的脂肪分解基因靶向源自人 SGBS 前脂肪细胞并受到相对于加扰对照 （shSCR） 的营养限制。带有相关虚线的深灰色条表示非营养限制对照。单因素方差分析/邓内特。每个点表示来自 n = 3 个独立生物重复实验的技术重复的平均值，并表示为平均值 SDM NEFA=非酯化脂肪酸。
e LIPA 通过 qPCR 评估用于 F. 敲低实验的显着性，用 Friedman’s/Dunnett 检验评估。每个点表示来自 n = 3 个独立生物重复实验的技术重复的平均值，并表示为平均值 SDM f 人脂肪组织外植体培养和对营养限制的脂肪分解反应。左=甘油;右=NEFA。药物抑制剂用于评估溶酶体依赖性脂肪分解（Bafilomycin，Lalistat2）。每个点表示来自n = 4个独立生物重复实验的技术重复的平均值，并表示为平均值，SDM单因素方差分析/邓内特（甘油）和弗里德曼/邓内特检验（NEFA）。Con=控制。
g 人脂肪组织外植体培养和对体外肾上腺素能刺激（儿茶酚胺）的脂肪分解反应：左=甘油;右=NEFA。药理学抑制剂用于评估溶酶体依赖性脂肪分解（Bafilomycin，Lalistat2）。每个点表示来自n = 4个独立生物重复实验的技术重复的平均值，并表示为平均值，SDM Friedman/Dunnett的检验。Con=控制。
见图六
网络医学识别与衰老基因和衰老疾病相关的人类禁食模块。
图六
a 来自纵向人类禁食研究的差异表达 （DE） 转录本被映射到巩固的人类相互作用组，其中包括 >230,000 个物理蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI）。DE 禁食转录本在相互作用组中形成了一个统计上不同的子网络（模块）。
b 来自衰老图谱的禁食基因和衰老基因的相互连接，映射到相互作用组。
c 中间中心性 （BC） 是一种基于最短路径的网络信息传输重要性的衡量标准，用于确定禁食和衰老表型之间相互作用的候选调节因子。这种无偏见的计算机分析将 MITF 确定为一个关键节点。
d 禁食模块与衰老疾病模块或心脏代谢疾病模块之间的网络接近。节点大小与模块中的基因/蛋白质数量成正比。边的宽度与邻近显着性成正比。
02
研究结论
总之，我们提出了一种禁食脂肪细胞脂肪分解模型，其中转录调节的溶酶体脂肪分解通过补充由肾上腺素能信号传导和快速信号转导激活的经典系统的急性活性，对适应性禁食反应至关重要。
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