大家好，今天跟大家分享一篇题为Ex osome-tran smitted HSPA9 facilitates borte zomib resistance by targeting TRIP13/USP1 signaling in multiple myeloma（外显子传递的HSPA9通过靶向多发性骨髓瘤中的TRIP13/USP1信号促进硼替佐米耐药性）多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的血液系统恶性肿瘤，是一种骨髓肿瘤性疾病。硼替佐米(BTZ)是MM治疗的一线选择性蛋白酶体抑制剂。
01
研究背景
对蛋白酶体抑制剂硼替佐米 （BTZ） 的耐药性对多发性骨髓瘤 （MM） 构成了巨大的治疗挑战。本研究旨在分析外泌体热休克 BTZ 抗性 MM 细胞分泌的 70 kDa 蛋白 9 （HSPA9） 传播对 BTZ 敏感 MM 细胞的耐药性的机制。
通过纳米颗粒示踪分析和透射电子显微镜鉴定血清外泌体。进行液相色谱-质谱和公共数据库筛选外泌体 HSPA9。细胞计数试剂盒-8 、 western blotting 和集落形成法检测 HSPA9 蛋白在体外的作用。采用免疫共沉淀、免疫荧光和蛋白截短试验实验确定 HSPA9-USP1-TRIP13 复合物的调控网络。进行体内和异种移植小鼠模型的光学成像，研究外泌体 HSPA9 促进 MM 增殖和 BTZ 耐药。
我们证明 HSPA9 在血清外泌体和 BTZ 耐药 MM 患者中高表达。敲低 HSPA9 在体外显著抑制肿瘤发生并逆转 BTZ 耐药。作为 HSPA9 的下游分子，甲状腺激素受体相互作用蛋白 13 （TRIP13） 在 BTZ 耐药 MM 患者中也高表达。从机制上讲，HSPA9 的羧基末端肽结合结构域为募集去泛素化酶泛素特异性肽酶 1 （USP1） 提供了一个平台，从而防止 TRIP13 蛋白降解。HSPA9-USP1-TRIP13 复合物在细胞质中表现出稳定性，其抑制作用显著增强 BTZ 在 vito 中的耐药性。
见图一
外泌体 HSPA9 和 HSPA9 蛋白在 BTZ 耐药的 MM 中高度表达。
图一
NTA （A） 和透射电子显微镜 （B） 验证了外泌体的大小和结构。红色箭头表示外泌体形态。比例尺，200 nm。
（C） 8 对 HD/MM 患者血清外泌体的 DEPs 热图。
（D） 外泌体 HSPA9 在 BTZ 敏感和 BTZ 耐药 MM 患者中的表达 （P = 0.04）。
（E-F）MM 患者外泌体 HSPA9 蛋白表达的 WB 分析和光密度定量 （P = 0.0095）。
（G） 外泌体 HSPA9 蛋白在 RPMI8226 BTZ 耐药 MM 细胞中高表达。
（H） BTZ 敏感性与 HSPA9 mRNA 表达呈负相关 GSE2658 （P < 0.001）。HSPA9 的高表达与 MM （I） 进展和 （J） 不良 OS 相关 （P 分别为 0.001 和 = 0.015 < 0.001）。
（K-L）BTZ 敏感和 BTZ 耐药 MM 患者骨髓 IHC 中 HSPA9 蛋白的表达 （P < 0.0001）。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001
见图二
HSPA9 蛋白在体外促进 MM 细胞增殖、BTZ 耐药性和干性特性。
图二
（A） WB 测定检测 HSPA9-KD 和 HSPA9-OE MM 细胞 （RPMI8226 和 U266） 的效率。
（B） CCK-8 检测检测 HSPA9-KD MM 细胞的细胞生长活力。
（C） CCK-8 检测评估了 MM 细胞在用剂量浓度的 BTZ 处理 24 小时后的活力。
（D） CCK-8 检测评估了 MM 细胞在用 5nM 浓度的 BTZ 处理 96 小时后的活力。
（E） 流式细胞术检测 MM 细胞在 BTZ 处理 24 小时后细胞凋亡。
（F） WB 检测 BTZ 处理 24 小时后裂解的 caspase3 蛋白凋亡。） MM 细胞中软琼脂集落形成和每组集落数 （P = 0.0014） 的代表性图像。比例尺，10 μm。
（H） WB 分析显示 HSPA9-OE MM 细胞中 NANOG 、 SOX2 和 OCT4 的多能标志物表达。数据以 SD ±平均值表示。
见图三
外泌体 HSPA9 从 BTZ 抗性细胞转移到 MM 中的敏感细胞。
图三
（A） WB 用于检测 HSPA9-OE 的效率。
（B） WB 用于检测 HEK293T-HSPA9-OE 细胞中外泌体的标志物。
（C） 外泌体来源的 HSPA9 逆转了 MM 中 HSPA9 敲低引起的细胞增殖抑制。
（D） CCK-8 测定检测外泌体 HSPA9-OE 诱导 HSPA9-KD MM 细胞恢复 BTZ 耐药的细胞生长曲线。
（E） WB 法和 （F） qRT-PCR 法检测 MM 细胞中加入外泌体 HSPA9 48 h （WB） 或 24 h （qRT-PCR） 后 HSPA9 的表达水平。
（G） Figdraw 的示意图。RPMI8226-HSPA9-OE-FLAG 和 RPMI8226-WT 细胞共培养 24 h，在 RPMI8226-WT 细胞中检测 PKH26 标记的内源性外泌体 HSPA9。DAPI 标记的细胞核和 Flag 标记的细胞。黄色箭头表示外泌体。比例尺，10 μm。
（H） PKH26 标记的外泌体 HSPA9 在 MM 细胞中内化的代表性图像。黄色箭头表示外泌体。
见图四
HSPA9 正向调节 MM 中的 TRIP13。
图四
（A） RPMI8226-WT 细胞中 HSPA9 免疫沉淀蛋白的 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝 （CBB） 染色。红框表示目标蛋白质。
（B） 通过 IP-MS 鉴定 TRIP13 的覆盖率、独特肽计数和 （C） 光谱。
（D） 进行 Co-IP 检测，对 RPMI8226 细胞中的 HSPA9 和 TRIP13 进行免疫印迹。免疫印迹对 （E） HSPA9-KD 或 （F） HSPA9-OE MM 细胞中 HSPA9 和 TRIP13 表达的影响。
（G） TRIP13-OE MM 细胞中 HSPA9 和 TRIP13 表达的免疫印迹。（H） HSPA9 和 TRIP13 在 RPMI8226 和 U266 细胞中免疫共定位。比例尺，10 μm。
（I） IHC 测定检测 MM 患者骨髓活检中 TRIP13 的表达 （P = 0.047）。
（J） 与基线相比，GSE31161数据库显示 TRIP13 在 TT2 和 TT3 方案的复发性 MM 患者中高表达 （P < 0.001）。
见图五
HSPA9-USP1 与细胞质中的 TRIP13 相互作用。
图五
（A） 热图和 USP1 蛋白的相对表达显示在 RPMI8226 （HSPA9-EV 和 HSPA9-OE） 细胞中 （P = 0.0205）。
（B） 从外到内显示了 25 个显著富集的 GO 术语。第一个圆圈表示 25 个丰富的通路。第二个圆圈表示背景蛋白质的数量和 P 值，条的长度与蛋白质的数量成正比。第三个圆圈表示该通路中的 DEP 数量。第四圈表示各途径中富因子值 （P < 0.01）。
（C） WB 测定检测到 HSPA9 的敲低增加了泛素化水平。
（D） 使用 TRIP13 抗体的 Co-IP 检测 MM 细胞中的泛素化水平。
（E） 对 RPMI8226 细胞中与 USP1 结合的 HSPA9 进行 Co-IP 测定。
（F） Co-IP 检测显示 USP1 与 RPMI8226 细胞中的 TRIP13 相互作用。
（G） 免疫荧光测定显示 HSPA9-USP1-TRIP13 复合物共定位于 MM 细胞的细胞质中。比例尺，10 μm。
（H） 对 MM 细胞中暴露于不同浓度 ML323 24 h 的 HSPA9、USP1 和 TRIP13 表达的 WB 测定。
（I） MM 细胞不同时间暴露于 CHX 的 HSPA9 、 USP1 和 TRIP13 表达的 WB 检测。
见图六
HSPA9 募集 USP1 并调节 TRIP13 蛋白的稳定性。
图六
（A） 在示意图中，HSPA9 的全长 （FL） 和截短突变体用 Myc 标签修饰。
（B） Co-IP 检测用于验证 Myc 标签抗体在 HEK293T 细胞中的转染效果。
（C-E）将 Myc-HSPA9 、 HA-USP1 和 FLAG-TRIP13 共转染到 HEK293T 细胞中 48 h。分别使用 Myc 标签、 HA 标签和 Flag 标签抗体珠进行 Co-IP 检测和 WB。
（F） 根据试剂程序使用 HSPA9 纯化蛋白进行体外泛素化。
（G） WB 测定法检测 MM 细胞中加入外泌体 HSPA9 48 h 后 USP1/TRIP13 的表达水平。
（H） 用 ML323 （10μM） 处理 96 h，CCK-8 测定法检测 HSPA9-KD MM 细胞系中的细胞活力。
（I） 在 RPMI8226 HSPA9-KD 细胞中过表达 TRIP13 和 USP1，评估 WB 测定以测量效率。
（J） 用 BTZ （5nM） 处理 96 小时，CCK-8 用于评估 HSPA9-KD MM 细胞系的细胞活力。
02
研究结论
我们的研究结果提出了一个开创性的分子调控网络，其中 MM 细胞衍生的外泌体 HSPA9 通过 USP1/TRIP13 信号通路传递 BTZ 耐药性。这项研究强调外泌体 HSPA9 是克服 MM BTZ 耐药性的有前途的靶点。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！