结果：
本研究纳入了 53 名 VRL 患者的玻璃体样本。VRL 病例的患者人口统计学和临床特征列于 就诊时的中位年龄为 60 岁（范围为 34 至 76 岁），其中 23 人（43%）为男性。所有患者均为人类免疫缺陷病毒（HIV）阴性，且无已知免疫缺陷。为研究 VRL 患者中 EBV 的患病率，作者开发了一种 ddPCR 检测法，用于定量玻璃体液中的 EBV DNA 拷贝。在 ddPCR 分析的 53 例中，15 例（约 28%）被确认为 EBV 阳性（ 见图 1A）。在临床样本分析之前，ddPCR 检测法使用世界卫生组织（WHO）EBV DNA 国际标准进行了验证，该标准显示线性定量范围为 10–106 IU/mL（R2 > 0.99）。最有力的证据表明 EBV 与肿瘤发生有关，是其在肿瘤细胞中的检测。因此，作者进行了 EBV 特异性免疫荧光检测，以识别玻璃体细胞学标本中 EBV 感染的细胞类型，样本编号均为 24、26、46、48 和 50 例，EBV 拷贝数均超过 104 个/ml。遗憾的是，由于玻璃体样本有限，五例中只有三例（第 24、26 和 48 例）有足够的免疫荧光检测材料。结果显示，EBV 编码蛋白爱泼斯坦-巴尔核抗原 1（EBNA1）在所有三例检测病例 CD20 阳性恶性细胞（肿瘤细胞）中均被检测到（ 见图 1B）。这一发现证实 EB 病毒感染 VRL 中的肿瘤细胞。
图 1。玻璃体样本中的 EBV 检测率。通过 ddPCR 检测到 53 份玻璃体液样本中的EBV DNA 拷贝。采用 B 免疫荧光染色检测 EBV 与 CD20 阳性肿瘤细胞的共定位。蓝色：DAPI 表示细胞核，绿色：CD20 表示 CD20 阳性肿瘤细胞，红色：EBNA1 表示 EBV 感染状态。左侧数字表示案件编号。图像以 400×倍倍率拍摄。比例杆：5 微米。
为评估 EBV 阳性 VRL 是否与 EBV 阴性 VRL 具有不同的临床病理学实体，进行了统计分析。EBV 阳性组和阴性组在性别、年龄、血清 LDH 或玻璃体白细胞介素-6（IL-6）水平上未发现显著差异。然而，EBV 阳性组的玻璃体白介素-10（IL-10）水平显著较高（P = 0.006）。此外，与 EBV 阳性 DLBCLs 一致，生存分析显示 EBV 阳性 VRL 患者的 PFS 显著缩短（P = 0.004），中位随访时间为 24 个月。 总之，这些发现表明 EB 病毒感染是 VRL 预后不良的风险因素。
图 2。EBV 阳性和阴性 VRL 患者的生存分析。EBV 阳性是衡量不良进展生存率的独立指标。使用对数秩检验进行了单变量 Kaplan-Meier 估计。EBV-，EBV 阴性;EB+，EBV 阳性;PFS，无进展存活期。底部的表格显示了关键时间点的高风险患者数量。
所有源自VRL 的 EBV 基因组都聚集到一个独立分支
近年来，深度测序技术的进步使得从临床样本中高通量测序 EBV 基因组成为可能。这些测序结果提出了假设，即特定的 EBV 菌株可能与某些 EBV 相关疾病相关。为研究 VRL 中的 EBV 基因组特征，选定了五个 EBV 拷贝数超过 104 拷贝/mL 的标本（通过 ddPCR 检测;见图 1，包括病例 24、病例 26、病例 46、病例 48 和病例 50）进行 EBV 靶向测序（EBV 全基因组测序）。所有五个 VRL 衍生 EBV 基因组的测序读段均与 EBV 参考序列（GenBank 注册号：NC_007605.1）比对。五个 VRL 衍生的 EBV 基因组相对于参考序列的覆盖率范围为 98.54%至 98.82%。目标区域的平均测序深度为 5500.78 倍，范围为 2763.55 至 6371.64 倍。组装的 EBV 基因组大小范围为 169317 碱基（VRL226）到 169791 碱基（VRL0605）。关于测序数据及这五个 VRL 衍生 EBV 基因组差异。
系统发育树利用本研究中收集的五个 VRL 衍生 EBV 的完整基因组序列及其他已发表的 EBV 基因组构建。由此产生的系统发育表明，所有源自 VRL 的 EBV 基因组形成了一个独立的分支，明显与来自中国多个地区的 EBV 菌株分离（ 见图 3），表明 VRL 可能具有独特的 EBV 基因组特征。
图 3。EBV 基因组序列的系统发育分析。系统发育树包括本研究中收集的五个 VRL 衍生的 EBV 基因组，以及来自中国多个地区的其他已发表的 EBV 菌株。系统发育分析采用基于全长 EBV 基因组的邻居连接算法，使用 MEGA12，引导值设为 1000。VRL226、VRL1111、VRL1421、VRL1949 和 VRL0605 分别对应图 1 中的案例 24、案例 26、案例 46、案例 48 和案例 50。
在VRL 患者中鉴定出 VRL 特异性 EBV 基因组变异
对五个由 VRL 衍生的 EBV 基因组进行了比较变异分析，使用参考 EBV 序列（GenBank 注册号：NC_007605.1）。平均每个样本识别出 799 个 EBV 单核苷酸变异（SNV），其中变化发生率最高的区域位于 80–100 kb 和 160–170 kb 区域（ 见图 4A）。编码潜膜蛋白 1（LMP1）、爱泼斯坦-巴尔核抗原 3C（EBNA3C）、爱泼斯坦-巴尔病毒 BamHI-PraL 片段 1（BPLF1）和 EBNA1 的基因显示出非同义突变的频率最高（ 图 4B）。为确定这些非同义突变是否特有于 VRL，作者采用基于 PCR 的深度测序，评估了 60 个非同义突变在 VRL 患者玻璃体液样本中的流行情况。这些结果与 EBV 阳性的淋巴结内 DLBCL（淋巴结样本）和 PCNSL（脑组织样本）进行比较。如图 4C 所示，LMP1 变异体 G331R 和 BPLF1 变异体 S2696T 几乎在所有样本中均被检测到，这与其他 EBV 相关癌症的先前报告一致（Palser 等，2015）。然而，新的突变热点，如 LMP1 中的 S229T 和 BPLF1 中的 G2248R，仅在 VRL 组中被观察到。每例检测到的所有突变均。这些发现共同表明存在 VRL 特异性的 EBV 基因组变异。
图 4。VRL 衍生 EBV 基因组的遗传变异分析。 五个 VRL 衍生 EBV 基因组中单核苷酸变异（SNVs）的全基因组分布。B 指五个 VRL 衍生 EBV 基因组中识别出的所有非同义突变数量。顶部：条形图表示每个样本的全部非同义突变。底部：热图代表每个基因的非同义突变数。每列代表一个样本，每行代表一个特定基因。从白色到蓝色的色变表示突变频率增加。C EBV 阳性 VRL 患者玻璃体液中 60 个非同义突变的患病率，与 EBV 阳性非 VRL 患者样本（包括淋巴结内 DLBCL 和 PCNSL）相比。白细胞表示未检测到突变，橙色细胞表示突变（VAF >0.50）。右侧列出了非 VRL 组和 VRL 组的突变频率。可能与 VRL 相关的变异以星号标注。DLBCL：淋巴结内弥漫性大 B 细胞淋巴瘤;PCNSL：原发性中枢神经系统淋巴瘤;VRL：玻璃体视网膜淋巴瘤。
总结
总之，作者的研究提供了支持 EB 病毒感染与 VRL 相关性的证据，并表明 EBV 变异检测可能作为区分 VRL 与其他类型 DLBCLS 的标志。未来研究应扩展到多中心队列，采用配对液体/组织活检，这将对制定适当的诊断和治疗策略发挥关键作用。此外，这些独特的 EBV 变异体究竟是积极推动 VRL 的发展，还是仅仅作为旁观者适应 VRL 的细分市场，尚待进一步研究。
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