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缺血性脑卒中占全部卒中事件的80%，动脉闭塞后的血流重建虽可挽救半暗带，却不可避免地触发“再灌注损伤”——补体瀑布、凝血级联、激肽系统被依次点燃，外周免疫细胞趋化浸润，血脑屏障（BBB）完整性丧失，突触蛋白被异常修剪，最终使二次神经损伤超过缺血本身。

中医将这一过程概括为“气虚推动无力、血瘀阻络、痰瘀互结”，补阳还五汤（BYHWD）作为益气活血法的代表方，临床用于急性期、恢复期及先兆干预已逾三百年，但其现代生物学靶点始终零散。

湖南省中西医结合心脑血管病重点实验室团队利用“病证结合”策略，以21 d力竭游泳叠加线栓大脑中动脉闭塞（MCAO）2 h/再灌注48 h，建立“气虚血瘀型脑缺血再灌注”大鼠模型，系统评价BYHWD的神经保护效应，并以血清-脑组织蛋白质组学为核心，首次揭示该方通过“同时抑制补体-凝血-激肽三大级联”发挥疗效，为中医经典方剂的现代化与精准化提供全新循证路径。

图1 论文首图

补阳还五汤可改善气虚血瘀型脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分、气虚血瘀证评分及脑组织病理损伤  

实验将雄性SD大鼠随机分为假手术、I/R、ES+I/R、BYHWD低剂量（11.1 g·kg⁻¹·d⁻¹）、BYHWD高剂量（22.2 g·kg⁻¹·d⁻¹）及丁苯酞阳性对照组，于造模前1 d开始灌胃，持续至再灌注48 h。Longa评分显示，ES+I/R组神经功能缺损分值高达2.8±0.4，显著高于单纯I/R组；BYHWD-H组降至1.2±0.3，疗效优于阳性药。气虚血瘀证量表（涵盖精神萎靡、舌色暗紫、尾端瘀点等）总分ES+I/R组达21.4±2.1，BYHWD-H组降至12.7±1.6，证实该方对“证”本身具有逆转作用。TTC染色显示，ES+I/R组梗死率27.5%、脑水肿率27.2%，BYHWD-H组分别降至8.5%与7.8%，脑水含量几乎恢复正常。HE与尼氏染色进一步显示，BYHWD-H使CA1区受损细胞率由52.6%降至20.1%，尼氏小体数目由11.5升至50.5，提示其对神经元结构与蛋白合成能力均有显著修复。以上结果从“症-证-病”三个层面同步证实，BYHWD可剂量依赖地改善气虚血瘀型脑缺血再灌注损伤，高剂量效应全面优于临床等效剂量，为后续机制研究锁定22.2 g·kg⁻¹·d⁻¹的最佳干预窗口。

图2 补阳还五汤可改善气虚血瘀型脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分、气虚血瘀证评分及脑组织病理损伤  

补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究：差异蛋白及其调控通路分析  

团队采用TMT-标记定量蛋白质组学，对血清与脑组织分别进行三次生物学重复，共鉴定到血清2888种、脑组织5398种蛋白。与假手术组相比，ES+I/R组血清中495种蛋白上调、239种下调，脑组织10种上调、30种下调；BYHWD-H干预后，血清598种蛋白上调、503种下调，脑组织12种上调、9种下调，提示外周血对药物响应更敏感。GO与KEGG富集发现，ES+I/R组“补体与凝血级联”通路在血清与脑组织中均显著激活（P<1×10⁻⁸），C3、C5、F12、F11a、纤维蛋白原（Fbg）等核心分子同步升高；BYHWD-H则显著抑制该通路，同时上调AMPK信号、催产素信号及“长期抑制”相关蛋白，提示其通过“抑制促炎-促凝网络+激活细胞保护信号”双轮驱动发挥疗效。值得注意的是，脑组织中Api-1（抗凋亡蛋白1）与Tgoln2（高尔基体转运蛋白2）在ES+I/R组显著下调，BYHWD-H使其回调至基线水平；而纤溶酶原（Plg）在损伤后升高，药物则抑制其表达，说明BYHWD可精准纠正缺血再灌注诱导的凋亡-自噬-纤溶失衡。该组学数据不仅首次描绘出BYHWD的“外周-中枢”差异蛋白全景图，也为后续功能验证提供高可信度靶点清单。

图3 补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究：差异蛋白及其调控通路分析。

补阳还五汤可减少补体C3在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚  

免疫荧光双重标记显示，ES+I/R组C3荧光强度在IBA1⁺小胶质细胞、GFAP⁺星形胶质细胞及CD31⁺内皮细胞中分别升高3.2、2.8、3.5倍，且与iNOS（M1型标志）高度共定位，提示补体激活与促炎表型耦合。BYHWD-H干预后，上述细胞C3平均荧光强度下降50%–60%，共定位系数降至假手术水平。进一步在体水平证实，药物使脑组织C3蛋白表达下降58%，血清C3a水平下降46%，说明其不仅减少C3合成，亦抑制其外周裂解。体外OGD/R神经元模型亦重复出C3下降效应，提示BYHWD对C3的调控具有细胞普适性。由于C3是三大补体通路的交汇点，其降低意味着经典、旁路及凝集素途径均被同步抑制，从源头削弱下游C5a及膜攻击复合物（MAC）的生成，为减轻“补体风暴”奠定基础。

图4 补阳还五汤可减少补体C3在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚  

补阳还五汤可减少补体C5a在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚  

C5a作为最强趋化因子之一，可触发NADPH氧化酶激活与线粒体ROS爆发。研究发现，ES+I/R组C5a在微血管床呈“蜂窝状”高表达，并与CD31共定位形成“血管周围晕”；BYHWD-H使其荧光强度下降55%，并显著减少C5aR在神经元膜上的聚集。共聚焦三维重建显示，药物干预后C5a-IBA1共定位体积下降62%，C5a-GFAP共定位体积下降58%，提示其对胶质细胞趋化活化具有双重阻断作用。Western blot与ELISA同步证实，脑组织C5a蛋白下调52%，血清C5a下降48%，与C3变化趋势一致，说明BYHWD通过“C3-C5轴”整体抑制补体瀑布。由于C5a是诱发中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的关键分子，其降低亦间接减轻微血栓形成，为后续“补体-凝血对话”研究提供逻辑衔接。

图5 补阳还五汤可减少补体C5a在小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的积聚  

补阳还五汤通过抑制补体和凝血级联通路的激活减轻脑缺血再灌注损伤  

凝血与补体在进化上同源，F12被C3a激活后通过F11a放大凝血信号，而激肽释放酶（KLK2）-激肽原（KNG1）-缓激肽（BK）轴又反向促进C3转化。实验发现，ES+I/R组F12、F11a、Fbg、KLK2、BK、KNG1在脑与血清中同步升高，BK水平达假手术组2.7倍；BYHWD-H使F12、F11a、Fbg蛋白表达下降45%–60%，血清BK、KNG1下降40%–50%，提示其阻断“补体-激肽-凝血”正反馈环。凝血四项检测显示，ES+I/R组APTT缩短至22 s，BYHWD-H恢复至30 s，接近基线，而PT与TT无显著变化，说明药物主要抑制内源性途径，对生理性止血影响极小，出血风险低。整体而言，BYHWD通过“C3-C5a-F12-F11a”轴同步下调补体与凝血活性，既减少微血栓形成，又抑制NETs-补体互促循环，实现“抗炎-抗凝”双效应，为中医药干预再灌注损伤提供了“单药多靶”范式。

图6 补阳还五汤通过抑制补体和凝血级联通路的激活减轻脑缺血再灌注损伤  

补阳还五汤可调节脑缺血再灌注后脑组织中炎症因子的表达，抑制血脑屏障损伤及突触异常修剪  

qPCR结果显示，ES+I/R组促炎因子TNF-α、IL-1β mRNA升高3.1、2.9倍，抗炎因子IL-4、IL-10下降55%、60%；BYHWD-H使TNF-α、IL-1β回调至基线，IL-4、IL-10升高1.8、2.2倍，呈现“抑炎-促修复”表型转换。BBB损伤方面，ES+IIR组IgG外渗增加3.3倍，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5下降50%–65%；药物干预后IgG荧光面积下降58%，三种紧密连接蛋白恢复至假手术80%水平，EB示踪亦证实 Evan’s 蓝渗出量下降54%。突触层面，ES+I/R组PSD95、SYN蛋白下降60%、55%，树突棘密度减少48%；BYHWD-H使两者恢复至基线85%以上，电生理检测显示海马LTP幅度由80%提升至120%，提示突触可塑性显著改善。由于补体C3b/C5a可直接介导小胶质细胞对突触的“修剪”，药物通过抑制补体激活，阻断“过度修剪”信号，从而保护神经网络完整性，为“气虚血瘀-髓海失养”的中医病机提供现代生物学脚注。

图7 补阳还五汤可调节脑缺血再灌注后脑组织中炎症因子的表达，抑制血脑屏障损伤及突触异常修剪

补阳还五汤显著降低补体C3a表达并抑制突触异常修剪  

在OGD/R神经元模型中，C3aR、C5aR荧光强度分别升高3.5、3.2倍，PSD95、SYN下降55%、52%；加入10% BYHWD含药血清后，C3aR、C5aR降至基线，PSD95、SYN恢复至90%以上。Western blot证实，C3、C3aR蛋白下降50%，而PSD95、SYN升高1.8、1.9倍，提示药物在细胞水平可重复整体动物效应。进一步以C3a 1 μg/ml直接刺激HT22细胞，24 h后细胞活力下降40%，LDH漏出升高2.2倍，突触蛋白被显著降解；5% BYHWD含药血清即可使细胞活力恢复至85%，LDH下降45%，PSD95、SYN回升至对照组80%，其效应与C3aR拮抗剂AMY-101相当。该系列实验自下而上证明，BYHWD对C3a-C3aR轴的抑制是其保护突触、减少异常修剪的关键环节，亦为解释临床“醒神开窍、益智复能”效应提供细胞学证据。

图8 补阳还五汤显著降低补体C3a表达并抑制突触异常修剪  

补阳还五汤可改善补体C3a诱导的神经元损伤并抑制突触异常修剪  

在C3a损伤模型中，免疫荧光三维重构显示，C3a刺激后神经元表面出现“C3aR簇”与“SYN缺失区”高度对应，提示C3aR聚集直接触发突触蛋白内吞；BYHWD含药血清使C3aR簇密度下降65%，SYN信号恢复连续性。转录水平检测发现，C3a可上调突触修剪相关基因C1q、MFG-E8、GAS6 2–3倍，药物则抑制其表达；同时下调突触发生相关基因BDNF、Arc、Homer1，药物使其回升。信号通路层面，C3a显著激活RhoA-ROCK2通路，磷酸化水平升高2.4倍，导致突触骨架塌陷；BYHWD阻断该通路，磷酸化下降50%，与前期蛋白质组学“下调RhoA/ROCK2”结果互为验证。综上，BYHWD通过“阻断C3a-C3aR-RhoA”轴，抑制突触骨架解聚与异常修剪，促进突触发生基因表达，实现“益气活血、生髓醒神”的现代化阐释。

图9 补阳还五汤可改善补体C3a诱导的神经元损伤并抑制突触异常修剪

小结

该研究以“病证结合-组学解析-多维验证”三线并举，首次阐明补阳还五汤通过同步抑制“补体-凝血-激肽”三大级联，减轻炎症风暴、微血栓及突触过度修剪，从而改善气虚血瘀型脑缺血再灌注损伤。其发现不仅填补了中医经典方剂在“补体调控”领域的空白，也为溶栓后早期干预提供了安全、多靶、可口服的候选方案。未来需进一步解析黄芪甲苷、羟基红花黄色素A等单体对C3转化酶、F12a的精确作用位点，并开展多中心、随机对照临床试验，以推动中医药精准防治脑卒中再灌注损伤走向世界。

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