尽管已有报道阿司匹林可以抑制非小细胞肺癌的细胞增殖（21 ），但其潜在机制和相关靶点尚未完全阐明。最近，许多研究表明外泌体 miRNA 和蛋白质是肿瘤转移的关键组成部分（ 22 – 24 ）。作者首先从接受或未接受阿司匹林治疗的非小细胞肺癌患者血浆中提取外泌体。如图 Table S1 所示，两组患者的背景特征无差异。随后作者进行 RNA 测序并分析外泌体中差异表达的 miRNA（ Figure 1A ）。RNA 测序分析显示阿司匹林影响了 5,685 个基因的表达，包括 3,367 个上调基因和 2,318 个下调基因（|log2FC| ≥1.0 和 FDR %<0.05； Figure 1A 和 Figure S1 ）。此外，GO功能与KEGG通路富集分析表明阿司匹林调节了细胞过程、生物调节、代谢过程、催化活性等，提示阿司匹林对非小细胞肺癌细胞具有广泛影响（ Figure 1B,1C ）。
阿司匹林抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。(A) 展示了 10 例未使用阿司匹林治疗的非小细胞肺癌患者和 10 例使用阿司匹林治疗的非小细胞肺癌患者血浆中差异表达的 miRNA 热图。红色代表高基因表达，蓝色代表低基因表达。每条带的颜色亮度反映了差异的倍数。(B,C) 进行了 KEGG 分析和 GO 富集分析，以鉴定参与生物通路的差异表达 miRNA。(D,E) 通过 CCK-8 试验检测阿司匹林对细胞增殖的影响。A549 和 H1299 细胞(D)用不同浓度的阿司匹林处理 24 小时或(E)用 4 mM 的阿司匹林在指定时间处理(n=4/组)。(F,G) 通过 Transwell 试验检测细胞迁移。细胞用 4 mM 的阿司匹林处理 24 小时。Transwell 试验的染色方法是结晶紫染色。在光镜下拍摄图像(标尺：50 µm)。在七个随机选择的视野中计数迁移细胞数量(n=4/组)。数据以均值±标准差表示。 **, P<0.01; ***, P<0.001. CCK-8, 细胞计数试剂盒8; DMSO, 二甲基亚砜; GO, 基因本体论; KEGG, 京都基因与基因组百科全书; miRNA, 微小RNA; NSCLC, 非小细胞肺癌。
为检测阿司匹林对肺腺癌细胞增殖和迁移的影响，首先用不同浓度的阿司匹林处理 H1299 和 A549 细胞，不同处理时间以优化阿司匹林处理条件。如图Figure 1D,1E 所示，阿司匹林以剂量和时间依赖的方式抑制 A549 和 H1299 细胞的增殖，通过 CCK-8 检测。此外，Transwell 实验进行的细胞迁移分析结果表明，阿司匹林抑制了 A549 和 H1299 细胞的迁移（ Figure 1F,1G ）。综上所述，这些结果表明阿司匹林减弱了非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。
作者对 TCGA 数据库进行了差异表达分析（ Table 3 ）。使用 R 包“limma”进行矩阵差异表达分析，从 LUAD 数据集中提取了 1,744 个基因（740 个上调和 1,004 个下调），从 LUSC 数据集中提取了 3,053 个基因（1,458 个上调和 1,595 个下调）（|log2FC| >1 和 FDR <0.05）（ Figure 2A,2B ）。三个数据集（TCGA 中的 LUAD、TCGA 中的 LUSC 和血浆来源的外泌体分析）的交集产生了 277 个差异表达基因（ Figure 2C ）。这些差异表达基因在 TCGA 数据集中进行单变量 Cox 比例风险回归分析筛选。这产生了 126 个在 LUAD 中有显著预后能力的基因和 48 个在 LUSC 中的基因。使用 R“survival”和“survminer”包在高表达或低表达组中进行分析。随后，选择了 113 个 log rank P<0.05 的基因作为独立预后指标。这之后与血浆来源的外泌体分析数据交集，获得了 7 个 NSCLC 预后标志物（PKNOX2、GPIHBP1、ADGRD1、CRTAC1、ST6GALNAC6、FAM83D 和 MACROD2）。 随后进行了生存分析，以测试这些预后标志物在 LUAD 中的适用性。LUAD 的 1 年曲线下面积（AUC）表明，预后风险评分在预测生存方面表现良好（ Figure S2 ）。考虑到 GPIHBP1 mRNA 水平的增加是这些基因中最显著的，作者选择了 GPIHBP1 进行后续分析（ Figure S3 ）。根据 pancancer 数据库 TNMplot 和 Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) 的表达谱分析，GPIHBP1 在肿瘤组织和正常组织之间存在显著差异（ Figure 2D,2E ），并且与延长生存时间相关（P<0.001; Figure 2F ）。此外，通过 Western blotting 检测了手术组织中 GPIHBP1 的蛋白水平。结果表明，与邻近正常肺组织（ANT）相比，肺肿瘤组织（T）中的 GPIHBP1 显著降低（ Figure 2G,2H ）。代表性免疫组化实验也显示了相似的结果（ Figure 2I ）。总体而言，上述结果表明 GPIHBP1 表达较低与肺癌预后较差相关。
对 GPIHBP1 数据集进行综合鉴定和富集分析。(A,B) (A) LUAD 和(B) LUSC 数据集中差异表达基因(DEG)的火山图。上调基因用红点表示；下调基因用蓝点表示。(C) DEG 的维恩图。(D,E) 来自(D) TNMplot 和(E) GEPIA 的 pancancer 中 GPIHBP1 的表达谱。(F) 使用 Kaplan-Meier 绘图器分析 GPIHBP1 在肺癌中的总生存期(OS)（左）和无进展生存期(FP)（右）。(G,H) 在 NSCLC 患者中，对 ANT（N）或肺肿瘤组织(T)的 GPIHBP1 表达进行 Western blotting 和定量(n=5/组)。(I) 在 NSCLC 患者中，对 ANT（N）或肺肿瘤组织(T)的 GPIHBP1 蛋白水平进行 IHC 染色分析。标尺(左)，200 µm。标尺(右)，50 µm。数据以均值±标准差表示。 ***，P<0.001。ANT，邻近正常肺组织；CI，置信区间；DEGs，差异表达基因；FDR，假发现率；FP，首次进展生存期；GEPIA，基因表达交互分析；GPIHBP1，糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1；HR，风险比；IHC，免疫组化；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；NSCLC，非小细胞肺癌；OS，总生存期；TPM，每百万转录本。
为进一步确定 GPIHBP1 在非小细胞肺癌（NSCLC）进展中的关键功能，作者通过操控 NSCLC 细胞中的 GPIHBP1 表达。如图 Figure S4A-S4F 所示，通过 siRNA 转染成功下调了 GPIHBP1 的蛋白和 mRNA 水平，并通过重组慢病毒转染在 A549 或 H1299 细胞中显著过表达了 GPIHBP1。首先，在阿司匹林处理的 NSCLC 细胞中观察到 GPIHBP1 蛋白和 mRNA 水平上调（ Figure 3A-3C ）。重要的是，GPIHBP1 过表达降低了 A549 和 H1299 细胞的迁移能力（ Figure 3D,3E ）、细胞增殖（ Figure 3F ），同时增加了凋亡细胞比例（ Figure 3G,3H ）。相反，GPIHBP1 敲低细胞的迁移和细胞增殖增加，而细胞凋亡减少（ Figure 3A-3H ）。更重要的是，在 EMT 分子水平上，过表达 GPIHBP1 的细胞中 E-钙粘蛋白显著升高，而 N-钙粘蛋白、波形蛋白和 MMP-9 水平显著抑制，而在 GPIHBP1 敲低细胞中观察到相反的现象（ Figure 3I-3L ）。综合这些数据表明，GPIHBP1 抑制了 NSCLC 细胞的迁移、细胞增殖和 EMT，同时促进了它们的凋亡。
GPIHBP1 的上调抑制了迁移、增殖和上皮间质转化，同时增强了细胞凋亡体外 。(A,B) Western blotting 和 GPIHBP1 表达的定量分析，针对用 DMSO 或阿司匹林（4 mM）处理 24 小时的 A549 细胞或 H1299 细胞（每组 n=4）。(C) 用 DMSO 或阿司匹林（4 mM）处理 24 小时的 A549 细胞或 H1299 细胞中 GPIHBP1 mRNA 水平的 qRT-PCR（每组 n=4）。(D-L) 通过构建的慢病毒转染过表达 GPIHBP1 蛋白，并通过小干扰 RNA 在 NSCLC 细胞中敲低。收集细胞进行迁移检测（通过(D,E) Transwell 实验）、细胞增殖检测（通过(F) CCK-8 实验）和凋亡检测（通过(G,H) Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)染色）。在光镜下拍摄图像（标尺：50 µm）。Transwell 实验的染色方法是结晶紫染色。通过 Western blotting 进行 E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和 MMP-9 蛋白表达的密度定量分析（I-L）（每组 n=4）。数据以均值±标准差表示。 ***，P<0.001。CCK-8，细胞计数试剂盒8；DMSO，二甲基亚砜；EMT，上皮间质转化；GPIHBP1，糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1；MMP-9，基质金属蛋白酶9；NSCLC，非小细胞肺癌；OE，过表达；qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应。
阿司匹林通过增加 GPIHBP1 表达抑制肺癌进展
为检验阿司匹林是否通过调节 GPIHBP1 表达来抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖和转移，作者用 4 mM 阿司匹林处理过表达或敲低 GPIHBP1 的 NSCLC 细胞 24 小时。Transwell 实验和 CCK-8 实验结果揭示，与对照组相比，阿司匹林处理后的 GPIHBP1 过表达 NSCLC 细胞表现出更显著的细胞迁移抑制和增殖抑制，同时阿司匹林对细胞凋亡的积极作用进一步增强（ Figure 4A-4E ）。此外，在 GPIHBP1 过表达的 NSCLC 细胞中，阿司匹林处理上调 E-钙粘蛋白，同时下调 N-钙粘蛋白、波形蛋白和 MMP-9（ Figure 4F-4I ）。作者的结果还显示，阿司匹林降低了细胞迁移、细胞增殖和上皮间质转化（EMT），同时增加了细胞凋亡，这一效应在 A549 细胞和 H1299 细胞中均被 GPIHBP1 敲低所减弱（ Figure 4A-4I ）。因此，作者可以得出结论，阿司匹林对肿瘤进展的抑制作用在 GPIHBP1 敲低的 NSCLC 细胞中受到损害。
阿司匹林对细胞增殖、迁移、上皮间质转化和凋亡的影响与 GPIHBP1 表达相关。(A-I) 在非小细胞肺癌细胞中，通过慢病毒转染过表达 GPIHBP1 蛋白或使用小干扰 RNA 敲低 GPIHBP1，随后用 4 mM 阿司匹林处理 24 小时。收集细胞，通过(A,B) Transwell 实验检测细胞迁移，通过(C) CCK-8 实验检测细胞增殖，通过(D,E) Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡。在光镜下获取图像（标尺：50 µm）。Transwell 实验的染色方法为结晶紫染色。通过 Western blotting 进行 E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和 MMP-9 蛋白表达的密度定量分析(F-I) (每组 n=4)。数据以均值±标准差表示。*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001。CCK-8，细胞计数试剂盒8；EMT，上皮间质转化；GPIHBP1，糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1；MMP-9，基质金属蛋白酶-9；NSCLC，非小细胞肺癌；OE，过表达。
GPIHBP1 在体外稳定了 CD36 在质膜上的表达
鉴于 GPIHBP1 在抑制肺癌进展中的重要作用，作者接下来研究了调控 GPIHBP1 介导的迁移、细胞增殖、凋亡和 EMT 的潜在分子机制。已有报道指出，GPIHBP1 在各种肿瘤类型中调节脂质代谢发挥重要作用（ 25 ）。CD36 也被证明在肺癌细胞中调节脂质代谢和肿瘤进展（ 26 ）。在作者的研究中，作者首先检测了经或不经阿司匹林处理的肺癌细胞中 CD36 的蛋白和 mRNA 水平。阿司匹林处理并未影响 CD36 的总蛋白和 mRNA 水平（ Figure S5A-S5C ）。此外，免疫共沉淀分析证实，在 A549 或 H1299 细胞的全细胞裂解物和质膜裂解物中，GPIHBP1 与 CD36 存在内源性相互作用（ Figure 5A-5E ）。此外，免疫荧光实验也表明 CD36 与 GPIHBP1 共定位（ Figure 5C,5F ）。考虑到 GPIHBP1 敲低并未显著影响 CD36 的总表达，作者接下来研究了 GPIHBP1 是否调控 CD36 从质膜向细胞质的转位。 有趣的是，作者发现 GPIHBP1 在非小细胞肺癌细胞中的敲低显著促进了 CD36 从质膜转移到细胞质中，这通过质膜裂解物中 CD36 表达的减少和细胞质裂解物中 CD36 表达的增多得到证实（ Figure 5G-5J ）。综上所述，作者的研究结果表明，尽管 GPIHBP1 不影响 CD36 的表达，但它与 CD36 相互作用，以稳定其在质膜上的转移。
GPIHBP1 使 CD36 在质膜上稳定。(A-F)对 NSCLC 细胞全细胞裂解物和质膜裂解物中 GPIHBP1 与 CD36 相互作用进行免疫共沉淀和免疫印迹分析（每组 n=4）。(C,F) NSCLC 细胞中 GPIHBP1（绿色）、CD36（红色）和 DAPI（蓝色）免疫荧光染色的代表性图像。标尺：20 µm。(G-J)通过构建的慢病毒转染过表达 GPIHBP1 蛋白或用小干扰 RNA 敲低 GPIHBP1 蛋白，在 NSCLC 细胞中进行 Western 印迹和 CD36 表达在细胞全裂解物、质膜裂解物和胞质裂解物中的定量（每组 n=4）。数据以均值±标准差表示。***, P<0.001。CO-IP, 共免疫沉淀；DAPI, 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；GPIHBP1, 糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1；ns, 无显著差异；NSCLC, 非小细胞肺癌；OE, 过表达。
GPIHBP1 敲低引起的促癌效应被 CD36 敲低所消除
为确定 GPIHBP1 的作用是否与 CD36 水平相关，研究人员对感染了 siGPIHBP1 的 NSCLC 细胞也进行了 si-CD36 处理以阻断 CD36 表达。如图Figure S6A-S6C 所示，通过 siRNA 转染成功下调了 CD36 的蛋白和 mRNA 水平。正如预期，CD36 敲低显著降低了 A549 和 H1299 细胞的迁移 ( Figure 6A,6B )、细胞增殖 ( Figure 6C ) 和 EMT ( Figure 6D-6G )，同时增加了凋亡细胞的比例 ( Figure 6H,6I )。重要的是，CD36 敲低阻断了 GPIHBP1 敲低对肿瘤进展的所有加剧作用 ( Figure 6A-6I )。与 GPIHBP1 敲低的 NSCLC 细胞相比，同时敲低 GPIHBP1 和 CD36 的 NSCLC 细胞表现出显著降低的迁移 ( Figure 6A,6B )、细胞增殖 ( Figure 6C ) 和 EMT ( Figure 6D-6G )，但凋亡细胞比例增加 ( Figure 6H,6I )。总体而言，GPIHBP1 敲低对肿瘤进展的加剧作用部分依赖于 CD36 的表达。
GPIHBP1 敲低引起的促癌效应被 CD36 下调所抵消。(A-I) 在非小细胞肺癌细胞中，通过小干扰 RNA 敲低 GPIHBP1 蛋白或 CD36。收集细胞用于检测细胞增殖和迁移（通过(A,B) Transwell 实验检测）以及细胞活力（通过(C) CCK-8 实验检测）。在光镜下拍摄图像（标尺：50 µm）。Transwell 实验的染色方法是结晶紫染色。E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和 MMP-9 的蛋白表达通过 Western blotting 进行定量分析（D-G）。通过 annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）染色检测细胞凋亡（H,I）（每组 n=4）。数据以平均值±标准差表示。***, P<0.001。CCK-8, 细胞计数试剂盒9；GPIHBP1, 糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1；MMP-9, 基质金属蛋白酶-9；ns, 无显著差异；NSCLC, 非小细胞肺癌。
GPIHBP1 过表达抑制了非小细胞肺癌的生长和转移 体内
为研究 GPIHBP1 在肺癌生长和转移体内中的作用，作者通过皮下移植荧光素酶标记的对照 A549 细胞或 GPIHBP1 过表达的 A549 细胞，在裸鼠中建立了异种移植模型。如图 Figure 7A,7B 所示，IVIS 光谱显示，与对照组相比，GPIHBP1 过表达显著降低了生物发光信号的强度。此外，移植到裸鼠体内的 GPIHBP1 过表达细胞的肿瘤体积和肿瘤重量明显小于移植到裸鼠体内的对照组细胞（ Figure 7C-7E ）。为确定 GPIHBP1 过表达对非小细胞肺癌细胞转移的影响，在通过尾静脉注射对照组和 GPIHBP1 过表达的 A549 细胞 30 天后处死小鼠。并对肺组织切片进行 HE 染色。结果表明，与对照组小鼠相比，GPIHBP1 过表达小鼠的非小细胞肺癌细胞转移减少（ Figure 7F,7G ）。总之，这些数据表明 GPIHBP1 过表达抑制了肺癌的生长和转移。
GPIHBP1 的过表达抑制了 NSCLC 细胞在体内的异种移植肿瘤生长和转移。将 A549 NC 和 A549 GPIHBP1 过表达细胞皮下移植到裸鼠体内。（A,B）4 周后收集肿瘤，测量肿瘤大小。在 4 周内进行代表性生物发光图像和生物发光图像信号强度的定量分析（每组 5 只）。（C）每 5 天记录一次肿瘤体积。（D,E）在 4 周内测量肿瘤样本的宏观外观和重量（每组 5 只）。（F,G）检测肺部转移性结节。通过尾静脉注射对照组和 GPIHBP1 过表达的 A549 细胞，小鼠再喂养 30 天后处死。获得裸鼠肺部的宏观外观和苏木精伊红染色的代表性图像，并计数小鼠肺部的（G）转移性肿瘤数量（每组 5 只）。标尺，400 µm。数据表示为均值±标准差。 ***，P<0.001。GPIHBP1，糖基磷脂酰肌醇HDL结合蛋白1；NC，阴性对照；NSCLC，非小细胞肺癌；OE，过表达。
总结
作者的研究提供了强有力的 体外 和 体内 证据，表明阿司匹林可以通过 GPIHBP1 依赖的方式抑制肺癌的进展和转移。此外，作者发现 GPIHBP1 直接与 CD36 相互作用，并且 GPIHBP1 敲低会破坏 CD36 的定位，这会促进非小细胞肺癌的进展和转移。作者的研究结果指向了一种有前景的肺癌预防和治疗策略。
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