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MIR205HG 已在多种癌症中被检测到，LUSC 组织和细胞系中 MIR205HG 的表达水平明显上调（1 ）。在这里，作者首先分析了 14 例 LUAD 组织和 14 例邻近组织中 MIR205HG 的表达。qRT-PCR 的结果显示，与邻近组织相比，LUAD 组织中 MIR205HG 表达增加（ Figure 1A ）。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示曲线下面积（AUC）为 0.7117（ Figure 1B ）。此外，作者检测了 6 例 LUAD 组织和 6 例邻近组织中 MIR205HG 的表达，qRT-PCR 的结果表明，与邻近组织相比，超过一半的 LUAD 组织中 MIR205HG 表达增加（ Figure 1C ）。这些结果表明 MIR205HG 可能是肺癌中一个新的潜在预后生物标志物。
MIR205HG 在 LUAD 中的表达。 (A) 散点图显示在 Seo RNA 测序（RNA-Seq）数据集中，LUAD 与正常组织中 MIR205HG 的高表达水平。 (B) ROC 曲线表明 Seo 数据集中 MIR205HG 的 AUC 为 0.7117。 (C) 与邻近组织相比，LUAD 组织中 MIR205HG 表达增加（P1-P6 代表“六个个体肺癌样本”，6 个 LUAD 组织vs. 6 个邻近组织）。 **, P<0.01; ***, P<0.001 (LUAD vs. 正常)。 AUC，曲线下面积；LUAD，肺腺癌；MIR205HG，MIR205 宿主基因；ROC，受试者工作特征。
敲低 MIR205HG 抑制 LUAD 细胞的增殖和集落形成
为确定 MIR205HG 对 LUAD 细胞增殖的影响，作者在 LUAD 细胞系中进行了 WST-1 和克隆形成实验。经 qRT-PCR 验证，转染 MIR205HG siRNA 后 MIR205HG 的表达下调（ Figure 2A,2B ）。敲低 MIR205HG 后，作者发现 A549 和 H1299 细胞的增殖受到抑制，抑制率达 30–60%（ Figure 2C,2D ）。克隆形成实验表明，敲低 MIR205HG 显著降低了 A549 和 H1299 细胞的克隆形成能力（ Figure 2E-2G ）。这些结果表明 MIR205HG 促进 LUAD 细胞的增殖和克隆形成。
MIR205HG 的敲低抑制 LUAD 细胞生长。(A,B)转染 MIR205HG siRNA 降低了 H1299 和 A549 细胞系的 MIR205HG 表达。(C,D)MIR205HG 的敲低减少了 H1299 和 A549 细胞系的细胞增殖。(E-G)MIR205HG 的敲低抑制了 H1299 和 A549 细胞系的集落形成。siCtrl 处理条件下的值设为 1 作为参考。数据显示为三次独立实验的平均值±标准差（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001vs. siCtrl）。LUAD，肺腺癌；MIR205HG，MIR205 宿主基因；OD，光密度；SD，标准差。
流式细胞术分析用于检测 MIR205HG 对 LUAD 细胞系凋亡的影响。结果显示，在 A549 和 H1299 细胞中敲低 MIR205HG 后细胞凋亡增加 (Figure 3 )。这些结果表明 MIR205HG 的敲低促进 LUAD 细胞凋亡。
MIR205HG 的敲低促进 LUAD 细胞的凋亡。(A) MIR205HG 敲低后 A549 细胞中 Annexin V/PI 染色的代表性流式细胞术图。(B) A549 细胞中凋亡细胞（Annexin V+）的定量。数据为三次独立实验的平均值±标准差。(C) MIR205HG 敲低后 H1299 细胞中 Annexin V/PI 染色的代表性流式细胞术图。(D) H1299 细胞中凋亡细胞（Annexin V+）的定量。数据为三次独立实验的平均值±标准差（**, P<0.01; ***, P<0.001vs. siCtrl 组）。LUAD，肺腺癌；MIR205HG，MIR205 宿主基因；SD，标准差。
敲低 MIR205HG 抑制 LUAD 细胞的迁移和侵袭
作者进一步使用 Transwell 迁移和侵袭实验来确定 MIR205HG 在 LUAD 细胞侵袭和迁移中的作用。与阴性对照组相比，作者发现敲低 A549 和 H1299 细胞系中的 MIR205HG 后，细胞侵袭能力被抑制了 30–72%，细胞迁移能力降低了 54–80%（ Figure 4 ）。因此，敲低 MIR205HG 可以抑制 LUAD 细胞的侵袭和迁移。
敲低 MIR205HG 抑制 LUAD 细胞侵袭和迁移。(A) A549 和 H1299 细胞的 Transwell 侵袭实验代表性图像（标尺：100 µm）；(B) A549 和 H1299 细胞侵袭细胞数量的定量分析。相对细胞数量相对于 siCtrl 组（设为 1）进行标准化。(C,D) A549 和 H1299 细胞的相应迁移实验结果：代表性图像（标尺：100 µm）（C）和定量分析（D）。数据为三次独立实验的平均值±标准差（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001vs. siCtrl）。LUAD，肺腺癌；MIR205HG，MIR205 宿主基因；SD，标准差。
MIR205HG 的敲低通过自噬和铁死亡途径抑制 LUAD 细胞的增殖、迁移和侵袭
自噬与细胞凋亡和程序性细胞死亡相关。这一特性使其在改善癌症治疗和预后方面变得越来越重要（15 ）。为了了解 MIR205HG 在肺腺癌（LUAD）中的功能机制，作者在 A549 和 H1299 细胞中敲低 MIR205HG 后，通过蛋白质印迹法分析了自噬相关蛋白。作者发现，在两种细胞系中敲低 MIR205HG 后，AMPK、BECLIN-1 和 LC3B-II 的表达增加，而 p62 和 mTOR 的表达减少（ Figure 5A-5C ）。鉴于自噬和铁死亡之间已知的相互作用，为了检验 MIR205HG 是否参与铁死亡，作者检测了其敲低对 A549 和 H1299 细胞中铁死亡相关蛋白表达的影响。蛋白质印迹分析显示，铁死亡抑制因子 GPX4 的表达水平降低（ Figure 5D,5E ）。此外，通过使用 DAPI-GFP-LC3B 串联荧光标记，作者观察到敲低 MIR205HG 后荧光斑点显著增加（ Figure 5F ）。这意味着敲低 MIR205HG 促进了表面自噬体的产生，并加速了自噬过程。 研究表明自噬与铁依赖性调节性细胞死亡（铁死亡）相关 ( 16 )。综上所述，这些结果表明抑制 MIR205HG 可激活 LUAD 细胞中的自噬和铁死亡。
MIR205HG 的敲低诱导 LUAD 细胞自噬并激活铁死亡。(A)在 MIR205HG 敲低后，A549 和 H1299 细胞中自噬相关蛋白[AMPK、BECN-1（BECLIN-1）、LC3B、p62 和 mTOR]的 Western blot 分析。(B,C)敲低 MIR205HG 后，蛋白表达水平的定量分析显示，敲低显著增加 AMPK、BECN-1（BECLIN-1）和 LC3B-II 的表达，同时降低 p62 和 mTOR 水平。(D)MIR205HG 敲低后铁死亡相关蛋白 GPX4 的 Western blot 分析。(E)GPX4 表达的定量分析。敲低 MIR205HG 显著降低 GPX4 水平。(F)代表性免疫荧光图像显示，敲低 MIR205HG 后 A549 和 H1299 细胞中自噬小体形成增加（绿色斑点）（标尺：100 µm。所有值相对于 GAPDH 进行标准化，siCtrl 处理条件设置为 1）。数据为三次独立实验的平均值±标准差（B,C,E）（*, P<0.05；**, P<0.01；***，P<0.001vs. siCtrl）。LUAD，肺腺癌；MIR205HG，MIR205 宿主基因；SD，标准差。
为全面探究 MIR205HG 在活体肿瘤生长中的作用，作者构建了小鼠肺异种移植模型。通过注射稳定表达 shNC（阴性对照小干扰 RNA）或 shMIR205HG（靶向 MIR205HG 的小干扰 RNA）的细胞来实现。实验结果明确表明，MIR205HG 的缺失导致小鼠肺肿瘤体积和重量显著减少（ Figure 6A-6D ）。此外，免疫组化（IHC）染色结果揭示，沉默 MIR205HG 有效降低了增殖标志物 Ki67 的表达（ Figure 6E ）。综合这些数据，强烈表明敲低 MIR205HG 可以抑制肺肿瘤在体内的生长和转移。
MIR205HG 的敲低抑制了肺癌在体内的生长。(A,B)由稳定转染 shMIR205HG 和 shCtrl（对照短干扰 RNA）的 A549 细胞形成的异种移植肿瘤的照片。(C)图表显示了 shMIR205HG 组和对照组小鼠随时间推移的肿瘤体积。(D)条形图显示了实验结束时的肿瘤重量。(E)对异种移植肿瘤进行 Ki-67 免疫组化染色以评估细胞增殖（标尺：100 µm）。MIR205HG，MIR205 宿主基因。
总结
作者发现 MIR205HG 是肺癌中的一个致癌因子。在 LUAD 中敲低 MIR205HG 后，通过自噬和铁死亡通路抑制了细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导了细胞凋亡。这些结果表明 MIR205HG 可能在肺癌中发挥重要作用。了解 MIR205HG 的功能机制可能为寻找肺癌的新型治疗方法提供基础。
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