文献速览：
小麦条锈病是一种全球流行的气传性真菌病害，严重危害小麦的安全生产。截至目前，共有87个抗条锈病基因（Yr基因）与超过300个与抗条锈病相关的QTL在小麦或其近缘物种中被挖掘。通过远缘杂交培育具有持久抗条锈病性的小麦新品种，是条锈病防控的一种经济、有效的策略。长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum）作为小麦三级基因库中的一个多倍体物种，蕴藏着多个抗病基因，已被广泛应用于小麦遗传改良。此前作者从一个小麦–长穗偃麦草部分双二倍体“小偃7430”中鉴定出一个具有全新条锈病抗性的小麦–长穗偃麦草6Js（6B）代换系X005。基于此，作者通过染色体涂染（Oligo-FISH Painting）以及非变性荧光原位杂交（ND-FISH）对“小偃7430”和X005的染色体组成进行鉴定。随后作者构建代换系X005与 感病小麦品种杂交后代群体并进行条锈病抗性鉴定，筛选出小麦-6Js染色体缺失系和易位系。利用75个分子标记构建高密度物理图谱，将其定位在6Js染色体短臂的0.53-0.67区段，对应于长穗偃麦草6E染色体的74.51-135.61 Mb区域。抗性鉴定试验表明，该位点在苗期和成株期均赋予小麦对条锈病的抗性。T6JsS-6BL代换系增强小麦条锈病抗性的同时，未对农艺性状产生明显的负面影响，为小麦抗病育种提供了新的种质资源，也对小麦近缘属种的优异抗病基因挖掘具有重要意义。
研究结论：
1.通过连续Oligo-FISH分析揭示小偃7430的核型
作者利用长穗偃麦草的特异性寡核苷酸探针Oligo-B11，对小麦–长穗偃麦草部分双倍体“小偃7430”进行了ND-FISH分析。结果表明，小偃7430包含16条长穗偃麦草染色体（图1a）。使用Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535进行的ND-FISH鉴定，结果表明，其余40条小麦染色体包括14条A基因组染色体、12条B基因组染色体（缺失一对6B染色体）以及14条D基因组染色体（图1b）。随后，作者利用七个特异性探针进行Oligo-FISH涂染，在小麦和长穗偃麦草的染色体整臂上检测到清晰的杂交信号。探针Synt6在6A和6D染色体对上，以及两对长穗偃麦草第6染色体上产生了强烈的绿色信号（图1c, d）。探针Synt1、Synt5（图1f）以及Synt3和Synt4（图1h）分别在小麦第1、5染色体对上以及长穗偃麦草第3、4染色体对上产生了特异的红色或绿色信号。通过联合使用Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535进一步鉴定小麦–长穗偃麦草杂交得到的染色体（图1e, g）。基于连续的FISH和寡核苷酸涂染结果，作者构建了这16条长穗偃麦草染色体的核型，并得出结论：长穗偃麦草的第1、2、3、4、5和7群染色体均成对存在，而第6群染色体则出现了四次，替代了小偃7430中缺失的6B染色体对（图1i）。即：小麦–长穗偃麦草部分双倍体“小偃7430”包含40条普通小麦染色体与16条长穗偃麦草染色体，其中小麦6B染色体对被长穗偃麦草的第6同源群染色体替换。
图1 小麦–长穗偃麦草双二倍体核型分析
2.小麦–长穗偃麦草代换系X005的核型鉴定与特征分析
作者利用Oligo-pTa535、Oligo-pSc119.2和Oligo-B11探针进行ND-FISH分析，在6Js长臂（6JsL）上观察到一个末端Oligo-pTa535信号，成功将代换系X005中的长穗偃麦草背景染色体与小麦背景染色体清晰区分（图2a-c）。通过Oligo-K288和Oligo-D探针构建ND-FISH图谱，进一步揭示X005中存在1RS·1BL易位染色体（图2b）。利用Oligo-pTa535、Oligo-pSc119.2、Oligo-B11和Oligo-(GAA)7探针绘制长穗偃麦草6Ae#3（替代6D）和6Ae#5（替代6A）代换系的核型（图2d-i）。ND-FISH结果显示，6Ae#3染色体在其短臂末端区域具有特异的Oligo-pSc119.2杂交位点，同时在其中间区伴有微弱的Oligo-pTa535信号。与之相反，6Ae#5染色体在使用Oligo-pSc119.2或Oligo-pTa535探针时均未显示任何信号。根据ND-FISH图谱的差异，可以判定X005中的6Js染色体与6Ae#3和6Ae#5染色体不同。
3.小麦–长穗偃麦草代换系X005中6Js染色体的遗传分析
ND-FISH分析证实，X005品系为一个6Js（6B）代换系，并且同时含有一对1RS·1BL易位染色体。为将X005中全新抗条锈病基因转移至普通小麦中，并探究6Js染色体在不同小麦遗传背景中的传递，作者将X005品系与小麦品种绵阳11，台长29以及中国春ph1b突变体进行杂交并自交，构建了F2群体。利用Oligo-B11、Oligo-K288以及Oligo-pSc119.2 Oligo-pTa535混合探针，对F2群体单株进行核型分析与筛选。图3展示了具有一对6Js染色体、一对1RS·1BL染色体、6JsS端体、6JsL端体、等臂端体6JsS·6JsS和等臂端体6JsL·6JsL的代表性植株。此外，作者进一步利用ND-FISH技术鉴定了共计1142株F3代植株，其中包括X005 × 绵阳11杂交组合的423株、X005 × 中国春ph1b组合的379株以及X005 × 台长29组合的340株。在这些植株中，160株（约占14%）含有两条6Js染色体，而331株（约29%）为6Js单体植株，表明6Js染色体具有中等的传递率。如表S3所示，在X005 × 绵阳11杂交组合中，6Js的传递率高于X005与台长29及中国春ph1b突变体的杂交组合。基于ND-FISH图谱，作者鉴定出13株包含6Js的染色体结构变异植株。其中，分别有4株和5株携带等臂端体6JsS·6JsS和6JsL·6JsL染色体。一株植株在6JsS上存在缺失。在所有研究的F3植株中，有两株检测到补偿性染色体易位，类型包括6JsS·6BL、6JsS·6DL、6BS·6JsL和6DS·6JsL（图4）。这些易位事件在X005 × 中国春ph1b突变体群体中发生频率最高。
图3 X005与3种普通小麦杂交F2代的ND-FISH核型分析
图4 F3代6Js染色体缺失系和易位系
4.小麦–长穗偃麦草6Js染色体缺失系与易位系的鉴定
为从X005与普通小麦杂交的F4代群体中获得小麦-6Js易位染色体的纯合植株，作者对两个整臂补偿性易位系X417（6BS·6JsL）和X932（6JsS·6BL）进行鉴定（图5a-d）。此外，利用Oligo-B11和Oligo-K288探针进行ND-FISH分析，鉴定出三个大片段纯合易位系（图5e-j）。如：易位系X39具有43条染色体，包括41条小麦染色体和两条涉及6Js与D基因组染色体的易位染色体（图5e）。利用Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2探针进行连续ND-FISH分析，在亚端部区域检测到一个强烈的红色信号，表明一段3DS染色体片段与6Js的远端区域融合，形成了3DS-6JsS·6JsL易位染色体（图5f）。易位系X193携带一个纯合的小麦-6Js易位染色体6AS-6JsS·6JsL，ND-FISH结果显示其断裂点位于6JsS的亚端部区域（图5g-h）。易位系X653具有41条染色体，其中包括两条1RS·1BL易位染色体和两条6JsS·6JsL-W易位染色体（图5i-j）。此外，在F4代后代中仅观察到一个纯合的6Js缺失系。缺失系X176含有44条染色体，其中包括两条发生断裂的6Js染色体。连续ND-FISH分析表明，其断裂点位于6JsS上（图5k-l）。上述结果表明，共鉴定出5个小麦–长穗偃麦草6Js染色体易位系：6JsS·6BL、6BS·6JsL、3DS-6JsS·6JsL、6AS-6JsS·6JsL、6JsS·6JsL-W及1个6Js缺失系。
图5 小麦–长穗偃麦草F4代6Js易位系和缺失系的FISH核型分析
5.分子标记开发与长穗偃麦草6Js染色体高密度物理图谱构建
为构建长穗偃麦草6Js染色体的物理图谱，作者利用162对引物筛选6Js特异性PCR标记。结果显示，有65对（40.1%）引物在含有6Js染色体的材料（包括小麦–长穗偃麦草双倍体“小偃7430”和代换系X005）中能扩增出特异性条带。通过分析6JsS和6JsL端着丝粒附加系的DNA，进一步将其中29个和36个标记分别定位到6JsS和6JsL染色体臂上。利用这65个6Js特异性标记测定了八个小麦–长穗偃麦草易位系和缺失系的断裂点位置，并将这些标记划分到七个物理区段（短臂四个，长臂三个）。为更精确地确定6Js上的断裂点，作者通过筛选二倍体长穗偃麦草6E染色体单拷贝序列，开发了45对6E特异性引物。其中有27个标记能在长穗偃麦草或小麦–长穗偃麦草部分双倍体8801中扩增出特异性片段。此外，包括6E_14.5、6E_67.2、6E_74.5、6E_91.1、6E_380、6E_456、6E_514、6E_520、6E_545和6E_550在内的10个特异性标记的引物对，在小偃7430、X005以及6Js染色体携带材料中也能扩增出特异性片段（图6a），表明这些引物可用于小麦背景中6Js染色体的检测。基于以上结果，作者成功构建长穗偃麦草6Js染色体的高密度物理图谱（图6b），并将75个标记定位到七个物理区段：分别将2、8、7、16、30、7和5个标记定位到染色体分群6JsS-4、6JsS-3、6JsS-2、6JsS-1、6JsL-1、6JsL-2和6JsL-3中。所构建的6Js高密物理图谱用于抗条锈病基因的精细定位。
图6 6Js染色体的特异性PCR扩增结果与高密度物理图谱
为对源自长穗偃麦草的三个第6同源群染色体进行差异分析，作者使用了66个6Js染色体的特异性标记。其中，与十倍体长穗偃麦草相比，分别有27个（40.9%）和17个（25.8%）标记在6Ae#5和6Ae#3染色体上产生了多态性扩增（图7）。此外，另有两对6E特异性引物，在相比于6Js和6Ae#3染色体时，能够在6Ae#5染色体上扩增出特异性条带（图7）。这表明6Ae#5染色体与长穗偃麦草E基因组的亲缘关系更近，并且与6Js染色体存在显著的序列分化。
已有研究表明，小麦–长穗偃麦草部分双倍体“小偃7430”对秆锈病表现出高抗性（Zheng et al. 2014）。因此作者利用秆锈菌生理小种98-1,2,(3),(5),6对其进行抗病性评价。结果表明，长穗偃麦草6Js染色体携带抗秆锈病的遗传位点（图8a）。利用Sr26和Sr61的特异性引物进行扩增的结果显示，十倍体长穗偃麦草、小偃7430、6Js（6B）代换系以及6Ae#5（6A）代换系可能含有Sr26或其等位基因（图8b-c）。
作者随后克隆了十倍体长穗偃麦草、6Js染色体和6Ae#5染色体的GSP序列（分别命名为Th. ponticum_GSP-Sr26, 6Js_GSP-Sr26, 6Ae#5_GSP-Sr26）。这些序列包含了Sr26基因NB-ARC和LRR结构域的大部分序列。三条序列长度均为1577 bp，与来自6Ae#1的Sr26的GSP序列相比，在LRR结构域均存在一处3 bp的缺失。蛋白质一级序列比对显示，四个序列的保守基序完全一致。然而，存在多达56个氨基酸位点的变化。其中，47个位点表现出75%的同源性水平，而9个位点显示50%的同源性水平（图8d）。结果表明，在长穗偃麦草的第6群染色体之间可能存在广泛的序列分化。这些氨基酸差异是否会影响基因功能，尚需进一步研究来确定。
图7 绵阳11、长穗偃麦草、8801、6Js (6B) 代换系、6Ae#5 (6A)
代换系、6Ae#3 (6D)代换系PCR扩增结果
图8 秆锈病抗病表现（a）、Sr26和Sr61特异性引物扩增结果（b、c）、Sr26 GSP序列比对结果（d）
7.条锈病抗性鉴定与抗条锈病基因定位
前期研究表明，代换系X005对条锈菌混合小种（CYR30、CYR31和CYR32）表现出高抗性，且其抗性源于6Js染色体（Hu et al. 2011）。为解析长穗偃麦草第6同源群染色体的条锈病抗性基础，挖掘其潜在的抗条锈病基因，作者在成株期对亲本品系X005、中国春、台长29和绵阳11、1RS·1BL易位系、6Js附加系、6JsS/6JsL端体附加系以及6Ae#5/6Ae#3代换系接种了条锈菌小种CYR32、CYR33和CYR34，并连续两年对其反应型IT进行评估（图9）。在成株期，品系X005、6Js染色体携带材料及6JsS短臂携带材料均表现高抗（IT = 0-1），而小麦品种绵阳11、中国春、台长29、1RS·1BL携带材料、6JsL长臂携带材料、6Ae#5及6Ae#3携带材料均表现感病（IT = 3-4）。这表明位于6JsS上的新Yr抗病位点对中国当前流行的条锈菌小种具有有效抗性。
为定位6JsS染色体上的抗条锈病基因，作者对9个纯合的6Js易位系与缺失系的条锈病抗性进行评价。其中7个品系（X417、X89、X193、X39、X257、X847和X653）表现抗病，而其余2个品系（X932和X176）表现感病（图10）。将该Yr基因定位至bin区段6JsS-2，该区段对应于长穗偃麦草6E染色体74.51-135.61 Mb的物理基因组区间（图10）。根据基因注释，该区间内共鉴定出768个基因（GWHGABKY032236至GWHGABKY033003）。其中，16个基因被注释为LRR类抗病蛋白或类串联激酶结构域蛋白。RNA-seq数据显示，在条锈菌侵染后，有7个基因在X005和6JsS·6BL易位系中表达。
图9 2023-2024和2024-2025年X005衍生品系抗条锈病表型分析
图10 6Js染色体上抗条锈病基因的染色体定位
8.小麦–长穗偃麦草易位系的农艺性状评价
在2023-2024与2024-2025年度生长季中，其农业气象参数基本一致。农艺性状分析表明，品系X417与6JsS附加系的穗长、每穗小穗数及千粒重均高于绵阳11。所有后代材料在穗粒数上均无显著差异。品系X417的株高低于X005及6Js/6JsL附加系。值得注意的是，X417的农艺性状优于X89，尤其在分蘖数与穗部形态方面表现更为突出（图11）。这些结果表明，补偿易位系T6JsS·6BL可作为同时改良小麦农艺性状与条锈病抗性的宝贵遗传资源。
图11 易位系农艺性状评价
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