该研究提出一种利用人类多能干细胞（hPSCs）为基础的Matrigel覆盖类器官分化在体外产生关键胰腺细胞类型的方案。这些细胞包括多能组细胞和双能祖细胞、内分泌祖细胞和产生激素的内分泌细胞。具体描述了培养hPSCs的步骤,将其培养为2D单层，应用Matrigel基质胶覆盖以创建3D上皮龛，并指导逐步分化。该系统支持活细胞成像以及形态发生和命运决定的实时跟踪，为研究胰腺器官发育和相关疾病提供了一个体外平台。
胰腺的发育是由内在细胞特性和引导祖细胞分化的外在线索之间复杂的相互作用驱动的。从hPSCs生成β细胞的传统方法主要集中在使用小分子或细胞因子逐步调节细胞内信号通路。然而，这些方法往往忽略了细胞外信号的关键作用，依赖于胰腺发育生物学和迭代优化的经验方法来实现β细胞分化。此外，在这些方案中缺乏3D结构细节限制了它们研究细胞外线索和形态变化如何调节早期胰腺发育的能力。为了解决这些局限性，本研究开发了一种基于hPSCs的Matrigel覆盖3D类器官分化系统，该系统在内分泌发生过程中重现体内上皮腔结构。该系统能够实现实时活细胞成像，从而可以精确监测动态细胞和形态变化，以及细胞内和细胞外信号通路之间的相互作用。通过提供胰腺发育的生理学相关模型，该方法增强了我们对祖细胞命运决定的理解，为完善分化方案、疾病建模和再生医学策略提供了潜在的应用。
实验方案示意图，流程包括种子分化、hPSCs培养（6-8 d）、内分泌祖细胞（13 d）、内分泌细胞（20 d）。
实验结果
解冻后1天，细胞融合率约为20%（图1A）。到第3日时，细胞融合率达到约90%，为传代做好准备（图1B）。在开始分化过程之前，hPSCs具有紧凑的形态、均匀的集落大小、约90%的融合以及超过95%的多能性标志物（OCT3/4、SOX2和NANOG）表达（图1B、1C）。分化细胞在第3天、第10天、第20天的活细胞均大于85%（图2）。
图1 hPSCs形态和多能性。(A) hPSCs解冻1 d后的形态（100 μm）。(B)待传代hPSCs形态（90%融合，100 μm）。(C)用OCT3/4、NANOG或SOX2抗体染色hPSCs的流式细胞术分析。
图2 流式细胞术分析细胞活力。流式细胞术分析分化细胞在第3天、第10天、第20天用Live/Dead染料染色。
该方案提供了一种方法以再现胰腺体外发育过程中上皮管腔结构的动态变化。通过一个精细的逐步分化的程序来促进胰腺内分泌细胞的有效生产。到第3天结束时，超过90%的细胞表达关键的确定性内胚层标志物，如FOXA2和SOX17（图3）。到第10天结束时，超过50%的细胞表达双效的胰腺祖细胞标志物，包括PDX1和NKX6.1（图3）。到第20天结束时，55%以上的细胞表达β细胞标志物INS，17%以上的细胞表达α细胞标志物GCG（图3）。该模型系统的分化效率与其他β细胞分化方案相当。此外，该方案有助于研究微环境信号如何在胰腺形成过程中调节内分泌细胞的发育。随着分化的进行，培养物在培养皿内形成上皮管腔结构，并经历以顶端结构域标记物EZRIN为特征的动态形态学变化（图4）。预期的结局包括上皮管腔结构在整个分化过程中的持续形成和动态重塑（图4），以及在分化结束时表达INS和/或GCG的内分泌细胞的高产量（图3）。这些培养物被设计成接近于体外胰腺发育，为实验研究和治疗应用提供了巨大的潜力。
图3流式细胞术鉴定分化效率。在第3天、第10天和第20天，用FOXA2和SOX17、PDX1和NKX6.1或INS和GCG抗体染色分化细胞进行流式细胞术分析。
图4 分化第13天上皮特征的表征。免疫荧光分析分化细胞在第13天用EZRIN染色。白色，EZRIN；绿色，NEUROG3-EGFP。比例尺，50 μm。
实验步骤
材料
参考文献
Tian C, Tiemann U, Hermann F, Semb H. Protocol for in vitro modeling of specification and morphogenesis of early pancreas development using human pluripotent stem cell-based organoid differentiation. STAR Protoc. 2025 May 21;6(2):103834. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103834. Epub ahead of print. PMID: 40402748.