大家好，今天跟大家分享一篇题为A nonca nonical function ofSKP1 regulatesthe switch between autophagy andunconv entional secretion（SKP1的非正则功能调节自噬和非常规分泌之间的转换）近年来，随着细胞生物学和分子生物学研究的深入，自噬和非典型分泌成为国自然的热门研究方向，特别是在神经退行性疾病、肿瘤生物学和免疫调节等领域。
01
研究背景
自噬-溶酶体系统对蛋白质和细胞器的细胞内降解对于细胞质量控制和能量稳态至关重要。除了降解之外，内溶酶体细胞器还可以与质膜融合并促进非常规分泌。在这里，我们确定了哺乳动物 SKP1 在内溶酶体中的功能，该功能与其作为 SCF/CRL1 泛素连接酶家族的重要组成部分的既定作用无关。
我们发现，在营养贫乏的条件下，SKP1 在 Thr 上被磷酸化131，允许其与 V 交互1液泡 ATP 酶 （V-ATP 酶） 的亚基。反过来，这一事件促进 V-ATP 酶组装，使晚期内体酸化并增强内溶酶体降解。在营养丰富的条件下，磷酸化 SKP1 的 SUMO 化允许其与 PPM1B 磷酸酶结合并被 PPM1B 磷酸酶去磷酸化。
去磷酸化的 SKP1 与 SEC22B 相互作用，促进酸化程度较低的杂化内体/自噬区室内容物的非常规分泌。总的来说，我们的研究将 SKP1 磷酸化作为自噬和非常规分泌之间的转换，其方式取决于细胞营养状况。
见图一SUMO化的SKP1与PPM1B的结合减少了Thr上的SKP1磷酸化131。
图一
(A） 在 HCT116 细胞中用对照免疫球蛋白 G （IgG） 或针对 SUMO1 的抗体对变性 IP 进行免疫印迹。箭头、SUMO-SKP1（黑色）和内源性 SKP1（Endo.SKP1）（灰色）。
（B） 从转染 Flag-SKP1、Myc-UBC9、SLX4 和血凝素 （HA） 标记的 SUMO-1、SUMO-2 或 SUMO-3 的 HEK293T 细胞中，在 IP 后使用 Flag 标签进行免疫印迹。左侧泳道显示了未转染 SUMO 质粒的对照。全细胞提取物 （WCE） 对照显示在底部。
（C和D）从表达Flag标记的SKP1的HEK293T细胞裂解物中变性IP后，指示蛋白的免疫印迹WT， SKP1K142R型， SKP1K163R或 SKP1K142R/K163R（SKP1RR).所有细胞均表达 HA-SUMO1 和 Myc-UBC9 质粒，并含有指定量的 SLX4 质粒。WCE 控件显示在底部 （C）。
（E 和 F） MS 分析 （E） 或免疫印迹 （F） 中检测到 SKP1 和 PPM1B 的 PSM 表，用于转染 SUMO化富集质粒（HA-SUMO1、Myc-UBC9 和 SLX4）和 Flag 标记的 SKP1 的 HEK293T 细胞中的 Flag co-IP 蛋白WT或 SKP1RR.没有转染 SUMOylation 富集质粒的对照 co-IP 显示在 （F） 的左侧泳道中。WCE 控件显示在底部 （F）。
（G）从转染SUMO化富集质粒（HA-SUMO1、Myc-UBC9和SLX4）、2Strep-SKP1和Flag标记的SENP1或SENP2的HEK293T细胞中，用链球菌标签亲和沉淀的蛋白质进行免疫印迹。不转染 SUMOylation 富集质粒的对照如左泳道所示。WCE 控件显示在底部。
（H）用对照siRNA处理后，在HeLa，HCT116和RPE1细胞中免疫印迹（−）或针对PPM1B（si-PPM1B）（+）的siRNA。
（I）SKP1免疫印迹WT和 SKP1RR用对照 siRNA （-） 或 si-PPM1B （+） 处理后的克隆。每个实验至少进行三次，结果相似。
见图二
Thr 上的 SKP1 磷酸化131促进其与 V-ATP 酶和 V-ATP 酶组装体的相互作用，与其与 F-box 蛋白的结合无关。
图二
(A） 从转染 SKP1 的 HEK293T 细胞中免疫共沉淀（co-IPed）的蛋白质的 PSM 表WT， SKPT131A型（磷酸化突变体）和 SKP1F139A/I41A（SKP1菲尔;F-box 结合突变体）在 MS 分析中检测到。
（B） 转染 Flag 标记的 SKP1 的 HEK293T 细胞的 Flag co-IP 的免疫印迹WT， SKP1T131A型和 SKP1T131E型（磷酸化模拟物）在没有 （-） 或 （+） siRNA 到 PPM1B （si-PPM1B） 的处理后。WCE 控件显示在底部。
（C）从表达Flag标记的V的细胞中共IP的蛋白质的免疫印迹0A 或 V0用 （+） 或不使用 （-） si-PPM1B 处理后的 D1。WCE 控件显示在底部。
（D） 与内源性 V 共 IP 的蛋白质的免疫印迹1在没有 （-） 或 （+） si-PPM1B 处理的细胞中的 B2。WCE对照如左，对照兔IgG的IP位于中间车道。
（E）从表达SKP1的细胞中分离的匀浆（H），细胞质（C），溶酶体（Ly）或LE / MVB中蛋白质的免疫印迹WT或 SKP1T131A型.（F）与内源性V共IP的蛋白质的免疫印迹1从表达 SKP1 的细胞中分离的匀浆 （Hom）、细胞质 （Cyt） 或 LE/MVB 中的 B2WT或 SKP1T131A型.WCE 和带有对照 IgG （IP-IgG） 的 co-IP 显示在左侧泳道上。
（G） 测量从 SKP1 中分离的 LE/MVB 中的 pH 值WT或 SKP1T131A型使用比例 LysoSensor 黄色/蓝色 DND-160 探头的细胞。n = 来自三个独立实验的 15 次测量。每个实验至少进行三次，结果相似。数据是 SEM 和单个值±平均值。使用未配对 t 检验 （G）。**P < 0.01 的差异显着。
见图三
营养剥夺诱导 SKP1 磷酸化，增强 LE/MVB 酸化。
图三
(A 和 B） 用对照 siRNA （NS） 或 si-PPM1B 处理的 HeLa 细胞的代表性免疫印迹 （A） 并在完全 DMEM 中孵育或在 EBSS 中孵育 1 小时后在指定时间孵育，随后重新引入完整的 DMEM（EBSS 后最小值）。pT 变化的量化131EBSS孵育1小时时的-SKP1水平如（B）所示。n = 6 个独立实验。
（C和D）在HeLa细胞中与内源性SUMO-1共IP的蛋白质的免疫印迹（C）或在表达该蛋白的细胞中与Flag标记的SKP1共IP的蛋白质（D）在完全DMEM中或在EBSS中孵育1小时后的指定时间保持，随后重新引入完整的DMEM（EBSS后的最小值）。
（E和F）从随意喂食（喂食）或饥饿24小时（饥饿）的大鼠肝脏中分离的指示部分的代表性免疫印迹（E）。匀浆 （H）、细胞质 （C）、LE/MVB （LE） 和溶酶体对伴侣介导的自噬 （Lys C） 或宏自噬 （Lys M） 具有活性。pT 的定量 （F）131-SKP1 水平相对于每个部分中总 SKP1 水平。n = 5 只大鼠。
（G 和 H）使用 LysoSensor 黄色/蓝色 DND-160 探头在来自 SKP1 的分离 LE/MVB 中测量 pH 值WT或 SKP1T131A型在表达SKP1的HeLa细胞中维持在DMEM或EBSS （G）中的细胞和pH值的变化（Δ）WT或 SKP1T131A型在EBSS中孵育1小时（H）。n = 5 或 15 个独立实验 （G） 或 7 个独立实验 （H）。每个实验至少进行三次，结果相似。数据是 SEM 和单个值±平均值。使用未配对 t 检验 [（B） 和 （H）] 和双因素方差分析与 Bonferroni 多重比较事后检验 [（F） 和 （G）] 。
见图四
SKP1磷酸化增强了饥饿期间的两栖体降解能力。
图四
(A 和 B） SKP1 的免疫印迹 （A）WT或 SKP1T131A型在补充 （+） 或不补充 （-） 血清的 DMEM 中生长的 HeLa 细胞 8 小时。在需要的情况下，用氯化铵和亮肽素（N / L）处理细胞以抑制内溶酶体蛋白水解。LC3B-II 通量（左）和 p62 降解（右）的定量 （B）。n = 6 个独立实验。
（C和D）在补充有（+）或没有（-）血清的DMEM中孵育8小时后，对没有（-）或（+）si-PPM1B处理的HeLa细胞进行免疫印迹（C）。在指示的情况下，用 N/L 处理细胞。LC3B-II 通量（上）和 p62 降解（下）的定量 （D）。n = 3 到 6 个独立实验。
（E和F）表达SKP1的细胞中的大自噬活性WT和 SKP1T131A型用GFP-RFP-LC3B串联荧光报告基因和si-PPM1B或对照（NS）转导。中性 pH LC3B 区室（GFP;RFP 点）（左）和 LC3B 酸性区室（GFP++++−;RFP puncta）（右）。n > 250 个细胞，每个细胞系两个细胞系。细胞核用 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 突出显示。
（G） 通过电子显微照片对表达 SKP1 的 HeLa 细胞中 APG、LE/MVB 和两性体丰度的形态学定量+WT或 SKP1T131A型.图像由两名对细胞系基因型不知情的专家进行独立定量。n 每个细胞系≥ 20 个字段，每个细胞系两个细胞系。
（H）SKP1中APG、LE/MVB和两性体的代表性电子显微照片T131A型细胞。比例尺，0.5 μm。数据是 SEM 和单个值±平均值。采用Tukey多重比较事后检验[（B）和（F）]和未配对t检验[（D）和（G）]的双因素方差分析。
原始和统计数据文件中显示了 （D） 的 Tukey 多重比较事后检验的双向方差分析，显示血清去除后两种情况的显着增加。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，差异显著。
见图五
SKP1去磷酸化促进外泌体分泌。
图五
(A）细胞培养基的免疫印迹，经差异超速离心以回收大ECV（10,000g），小ECV（100,000g）和沉淀的游离可溶性蛋白（TCA）。
（B）分离的ECV的代表性透射电子显微照片。比例尺，200 nm。
（C和D）来自免疫电镜的代表性图像，具有针对CD63的抗体（C）和SKP1小ECV组分中CD63囊泡的定量（D）+WT和 SKP1T131A型HeLa细胞。比例尺，200μm;n = 60张图像。
（E）来自SKP1的WCE和ECV的免疫印迹WT和 SKP1T131A型HeLa细胞在DMEM中培养16小时，含（+）或不含（-）血清。丽春红显示出不同的电泳模式。
（F和G）通过NanoFCM分析从SKP1培养基中分离的ECV组分中的囊泡数量WT和 SKP1T131A型细胞 （F） 或 SKP1WT在血清或血清中用对照 siRNA （Ctrl） 或 si-PPM1B 处理的细胞+−条件 16 小时。n = 3 个独立实验。（H）表达SKP1的HeLa细胞的WCE和ECV的免疫印迹WT并在没有（-）或（+）si-PPM1B在DMEM中培养，用血清补充（+）或不（-）处理16小时。（一）日志2折叠变化（日志2FC）从SKP1分离的ECV之间的蛋白质丰度WT或 SKP1T131A型HeLa 细胞。灰色、不显着的蛋白质。富集的GO项是彩色标记的，并显示了每个途径的代表性蛋白质。每个实验至少进行三次，结果相似。数据是 SEM 和单个值±平均值。使用未配对 t 检验 [（D） 和 （F）] 或带有 Bonferroni 多重比较事后检验 （G） 的双因素方差分析。
见图六
SEC22B 介导 SKP1 触发的蛋白质分泌。
图六
(A 和 B） 表达 Flag 标记的 SKP1 的 HeLa 细胞中来自 Flag co-IP 的蛋白质的免疫印迹WT或 SKP1T131A型（A） 或用 Flag 标记的 SKP1 转染的 Expi293F 细胞WT， SKP1T131A型或 SKP1F139A/I141A（FI）（B）. WCE 控制显示在左侧车道中。用DSS交联剂（1 mM）处理1小时后进行（A）和（B）中的Co-IP。
（C） 表达空载体对照 （EV） 或 Flag 标记的野生型 （WT） SEC22B （SEC22BWT）或不能结合SKP1的SEC22B形式（SEC22BK38A型)。
（D）从表达SKP1的HeLa细胞培养基中获得的WCE和ECV的免疫印迹T131A型用对照siRNA （-） 或 si-SEC22B （+） 处理后，并在补充或不补充的 DMEM 中培养（血清+−）与血清16小时。丽春红显示WCE和ECV组分的不同电泳模式。
（E和F）来自免疫电镜的代表性图像，具有抗CD63抗体（E）和表达SKP1的HeLa细胞小ECV组分中CD63囊泡的定量（F）+T131A型用对照siRNA（NS）或si-SEC22B处理后。比例尺，200μm;n = 60 张图像。
（G 和 H）分泌囊泡数 （G） 和 ECV 大小 （H） 基于从 SKP1 培养基中分离的 ECV 的 NanoFCM 分析T131A型用在DMEM中培养的对照siRNA（Ctrl）或si-SEC22B处理的细胞，补充（+）或不补充（-）血清16小时。n = 3个独立实验，每个条件有>4000个囊泡。代表性直方图如图S9E所示。每个实验至少进行3次，结果相似。数据是均值±SEM和单个值。使用未配对t检验（F）或双向方差分析与Bonferroni的多重比较事后检验[（G）和（H）]。
02
研究结论
总之，这些结果表明，未磷酸化的 SKP1 结合 SEC22B 以促进两栖体货物的非常规分泌。我们提出，SKP1 磷酸化对营养状态的依赖性使该蛋白质能够控制细胞的降解和分泌能力，以响应营养可用性。
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