原创 Heisenberg 创新药note 2025年08月08日 15:07 江西
1.从发现到临床应用：RNA干扰技术的二十五年
1998 年，安德鲁·费尔（Andrew Fire）、克雷格·梅洛（Craig Mello）及其同事发现双链 RNA 能够在秀丽隐杆线虫中触发 RNA 干扰（RNAi），从而催化降解互补的 mRNA 转录本，这一发现不仅为研究人员提供了强大的工具，还激发了制药开发的热情。2001 年，埃尔巴希尔（Elbashir）等人和卡普伦（Caplen）等人在哺乳动物细胞中证实了 RNAi 的存在。仅仅一年后，麦卡弗里（McCaffrey）等人通过流体动力学传递在小鼠中展示了 RNAi 活性。许多开创性的工作极大地推动了治疗性小干扰 RNA（siRNA）向体内应用的发展。这些早期的努力促进了我们对 RNAi 在各种应用中的潜力的理解，包括细胞靶向递送、疾病等位基因选择性靶向和抗病毒疗法。利用 RNAi 诱导的基因沉默进行治疗开发的概念看似简单且极具吸引力——本质上，只需重写 siRNA 的碱基序列就能关闭任何分子靶点。早期的临床项目进展迅速，使用的是未经修饰或稍加修饰的 siRNA。人们希望感兴趣的组织能够吸收足够的化合物以提供治疗效果。2010 年，戴维斯等人首次报道了通过全身给药在人体内实现 RNA 干扰的证据。然而，第一代化合物要么临床疗效微乎其微，要么毒性不可接受。人们很快意识到 siRNA 面临着诸如免疫原性和脱靶效应等严重障碍，这使得人们对这项技术产生了怀疑，制药公司纷纷削减资金并放弃了他们的 RNA 干扰平台。
到 2010 年代初，过高的期望已经削弱了小干扰 RNA（siRNA）药物开发领域的热情。RNA 干扰平台 从失败中吸取教训，我们现在对其中起作用的潜在生物学机制有了更清晰的认识，也明白了要使 siRNA 发展成为具有可接受的药代动力学和药效学（PK-PD）特性以及疾病修正潜力的候选药物，必须进行重大的化学创新。这一知识极大地促进了具有良好疗效和安全性特征的 siRNA 在肝脏中的临床应用。2018 年，一个重要的里程碑被达成，美国食品药品监督管理局（FDA）首次批准了用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的首个 siRNA 药物 patisiran。如今，siRNA 药物已进入市场，还有许多其他药物处于临床验证的后期阶段，正在接受测试以治疗各种疾病，包括神经退行性疾病、肌肉疾病和眼部疾病。该领域再次繁荣起来，其显著特点是从罕见遗传疾病转向常见疾病。这在最近 zilebesiran 治疗高血压的积极临床结果中得到了体现以及 inclisiran 在欧盟（2020 年）和美国（2021 年）获批用于治疗高胆固醇血症——动脉粥样硬化性心血管疾病的主要诱因。随着高级临床项目取得的有力成果以及递送技术的创新进展，预计很快会有更多针对肝脏和肝外组织的 siRNA 药物问世。
2.RNA 干扰（RNAi）机制
RNA 干扰（RNAi）是真核细胞的一种重要防御机制，能够降解诸如病毒之类的外源入侵遗传物质。RNAi 的机制主要涉及两种类型：微小 RNA（miRNA）和小干扰 RNA（siRNA），它们对基因调控至关重要。miRNA 由内源基因转录而来，其初级转录本（pri-miRNA）在细胞核内由 Drosha 和 DGCR8 加工形成前体 miRNA（pre-miRNA）。随后，pre-miRNA 由 Exportin 5 运输至细胞质，在那里由一种名为 Dicer 的酶进一步加工，去除发夹结构。加工后的pre-miRNA 被加载到 RNA 诱导沉默复合体（RISC）中，该复合体包含 Argonaute 1-4（Ago1-Ago4）蛋白，并与互补的 RNA 链分离。miRNA-RISC 复合体以不完全互补的方式与靶 mRNA 的 3’非翻译区（UTR）结合，最终导致 mRNA 降解或抑制 mRNA 翻译。相反，siRNA 介导的 RNAi 则始于双链 RNA（dsRNA）被引入细胞。这种双链 RNA 可以来自多种来源，包括病毒等外源遗传物质或合成的小干扰 RNA（siRNA）。进入细胞后，双链 RNA 会被 Dicer 识别并加工，Dicer 会将双链RNA切割成更小的片段，通常长度约为20个核苷酸。这些片段随后被加载到一种被称为 RNA 干扰复合物（RISC）的蛋白质复合物上。在 RISC内，双链 RNA 的其中一条链，即所谓的引导链，被选择出来引导复合物找到其目标 mRNA。RISC 的引导链通过碱基配对与目标 mRNA 上的互补序列结合。这种相互作用会招募并激活诸如 Argonaute 2（Ago2）之类的蛋白质，从而促进目标 mRNA 的切割或降解。因此，相应蛋白质的生成受到抑制或显著减少。RNA 干扰在研究中是一种强大的工具，并展现出潜在的治疗应用（图 1）。
图1：微小 RNA（miRNA）和小干扰 RNA（siRNA）的作用机制。miRNA 前体在细胞核内生成，然后由 Drosha 和 DGCR8 加工形成前体 miRNA。前体 miRNA 通过 Exportin 5 运输至细胞质，在那里进一步由 Dicer 加工去除茎环结构，形成成熟的miRNA。miRNA与靶mRNA 结合形成 miRNA-RISC 复合物，二者不完全互补，导致 mRNA 降解和翻译抑制。siRNA 的前体，如双链 RNA（dsRNA）被识别并切割成片段，通常为 21-23 个核苷酸长。这些片段随后被整合到 RNA 诱导沉默复合物（RISC）中。一旦形成，miRNA-RISC 复合物通过碱基配对与靶 mRNA 结合，然后 RISC 中的 Argonaute 2（Ago2）切割靶 mRNA，最终导致其降解和翻译抑制。
3.小干扰 RNA（siRNA）药物研发面临的挑战
第一个挑战在于 siRNA 在生理条件下固有的不稳定性，使其容易被迅速清除。如图 2 所示，生理环境中存在大量核酸酶，siRNA 进入血液后会被迅速降解。此外，血液、肝脏、脾脏等组织和器官中富含吞噬细胞，尤其是在单核吞噬系统（MPS）/网状内皮系统（RES）中，包括单核巨噬细胞、吞噬细胞和中性粒细胞，它们会吞噬进入体内的 siRNA。而且，在 siRNA 循环至肾脏的过程中，大量 siRNA 会通过肾小球滤过而被有效清除。未修饰的 siRNA 在血液中的半衰期很短，仅持续几分钟到一小时。即使 siRNA 成功到达靶细胞，它最初也会遇到内体和溶酶体，内体和溶酶体的环境呈酸性，pH 值在 5 – 6 之间，而溶酶体内的 pH 值更低，为 4.5。这些细胞器中含有多种能够迅速降解 siRNA 的核酸酶。
第二个挑战涉及游离 siRNA 的细胞摄取。由于其亲水性和负电荷特性，siRNA在试图穿过带负电荷的疏水性细胞膜进入细胞时会遇到障碍，导致电荷排斥和不可渗透性。第三个障碍涉及siRNA从核内体逃逸。siRNA组装成 RISC 复合物以实现基因沉默的过程只能在细胞质中进行。然而，siRNA自由穿透生物膜的能力有限，需要采取策略实现高效的内体逃逸并释放到细胞质中，这给 siRNA 的递送造成了障碍。第四个障碍涉及 siRNA 的免疫原性。Toll 样受体（TLRs）是免疫细胞上表达的模式识别受体，能够识别病原体相关分子模式，包括 CpG DNA 和病毒双链 RNA。TLR3、TLR7 和 TLR8 能够特异性识别 siRNA 中的核苷酸序列，例如 UG 二核苷酸和 5’-UGU-3’ 基序。当被注射入体内时，siRNA 会激活先天免疫系统，导致大量细胞因子的产生。
图 3 阻碍 siRNA 递送的因素包括：在血液中 siRNA 分子的降解，导致传递效率降低；内源性酶对 siRNA 的降解；细胞摄取效率低；细胞内转运障碍；以及穿过细胞膜的障碍。这些障碍可能降低 siRNA 的治疗效果
第五项挑战聚焦于 siRNA 的脱靶效应。尽管 siRNA 由 20 个核苷酸组成，在碱基互补配对方面具有很高的特异性，但细胞内存在大量长链的 mRNA 和 miRNA。siRNA与这些分子的不完全互补配对会导致非目标 mRNA 和 miRNA 的降解，从而产生非特异性的基因调控效应。此外，细胞表达多种 miRNA 以调节基因表达，而这些 miRNA可能与目标 mRNA 序列相同。因此，siRNA 不仅会降解目标 mRNA，还会降解 miRNA，导致基因表达出现不可预测的变化。如前所述，小干扰 RNA（siRNA）在癌症治疗中具有巨大潜力，但同时也面临着诸多挑战。因此，确定安全且高效的递送策略以充分发挥 siRNA 药物在癌症治疗中的优势至关重要。简而言之，siRNA 递送系统必须满足以下要求：1）确保 siRNA 在血清中的稳定性；2）促进 siRNA 免疫逃逸；3）减少 siRNA 与血浆蛋白和吞噬细胞的相互作用；4）防止肾清除；5）增强 siRNA 穿过血管的能力。6）促进细胞对 siRNA 的摄取；7）促进 siRNA 从内体中逃逸；8）具有高生物相容性和无毒性。只有满足这些条件，才能实现 siRNA 药物的有效递送。
4.小干扰 RNA（siRNA）药物的递送策略
小干扰 RNA（siRNA）作为治疗药物时，面临诸如半衰期短、血清稳定性差以及易受核酸酶降解等挑战。此外，其负电荷特性阻碍了其通过细胞膜轻松进入细胞，并且容易被细胞内溶酶体降解。因此，直接将 siRNA 用作治疗药物来治疗疾病颇具难度。为了克服这些局限性，化学修饰和纳米递送系统已成为促进 siRNA 药物治疗应用的常见策略。
化学修饰的 siRNA
虽然化学修饰本身并非 siRNA 的递送载体，但它在增强 siRNA 的固有特性方面发挥着关键作用。通过采用适当的化学修饰，可以显著提高 siRNA 在血清中的稳定性、免疫逃逸能力和与 RISC 的组装效率。因此，在介绍 siRNA 递送载体之前，探讨化学修饰对 siRNA 递送效率的影响是十分必要的。
总体而言，小干扰 RNA（siRNA）提供了多个可进行化学修饰的位点，包括末端、骨架、核糖基团和碱基。图 4 展示了几种常用的 siRNA 修饰方法。实验证据表明，硫代磷酸酯（PS）修饰可增强修饰材料的核酸酶抗性、药代动力学特性和血清稳定性。然而，过度的 PS 修饰可能会导致严重的毒性作用。此外，siRNA 核糖的 2′-氟（2′-F）或 2′-O-甲基（2′-OMe）修饰在商业 siRNA 中得到了广泛应用。这些修饰可提高血清稳定性、延长半衰期、增强 RNA 干扰能力并减少脱靶效应。其他 siRNA 的修饰方法包括在亚甲基连接的核糖的 2’和 4’ 位置引入锁核酸（LNA），以及将 RNA 主链 3′ 端的磷酸二酯核苷酸替换为硫代磷酸酯。此外，用小分子 2,4-二硝基苯酚（DNP）修饰 siRNA 不仅能减少核酸酶降解，还能通过帮助穿过细胞膜来促进细胞摄取。
尽管存在多种增强 siRNA 稳定性和其他特性的修饰方法，但在使用化学修饰时，必须在基因沉默效果和安全性之间取得平衡。需要注意的是，某些化学修饰可能会影响 siRNA 的有效性。例如，在 siRNA 反义链中引入硼磷酸修饰可增强其抗核酸酶降解能力，但会降低 RNA 干扰的效果。就安全性而言，常规 siRNA 降解产生的核苷酸与体内自然存在的核苷酸无异。然而，许多用于修饰的化学物质并非人体内源性物质。因此，对这些化学修饰的 siRNA 在人体内代谢产生的物质的安全性进行严格评估至关重要。
图4：常用于 siRNA 治疗的化学修饰。根据 RNA 核苷酸的结构，可将其分为磷酸基团（粉色）、核糖（紫色）和碱基（黄色）修饰。此外，配体（绿色，如 GalNAc、抗体和肽）能够实现对特定细胞类型的靶向递送。
siRNA 递送系统
除了化学修饰之外，研究人员还开发了多种类型的递送系统，以促进 siRNA 运输到靶组织和细胞中。递送系统大致可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体以其高效的核酸递送能力而闻名（图 5A）；然而，它们存在一些局限性，如：1）某些病毒只能将核酸递送至分裂细胞；2）核酸装载量有限（≤ 5 kb）；3）潜在的免疫原性和毒性；4）插入诱变的风险。鉴于关于病毒载体已有大量综述，本文重点对非病毒 siRNA 载体进行系统描述（图 5B-E）。
图 5 用于将 siRNA 递送至靶组织和细胞的递送系统可分为（A）病毒载体和（B – E）非病毒载体。Alnylam 制药公司几种候选药物中所用的三触角型半乳糖胺的结构。
基于脂质的 siRNA 递送系统
基于脂质的 siRNA 递送载体包括多种类型，如阴离子脂质体、中性脂质体、阳离子脂质体、稳定核酸脂质颗粒（SNALPs）和脂质类纳米颗粒（图 5B）。其中，阳离子脂质体（如商业化的 Lipofectamine）在 DNA 和 RNA 转染（包括 siRNA 转染）方面已具有重要意义。特别是 Lipofectamine RNAiMAX 在细胞水平上实现了极高的转染效率，表现出显著的效果。阳离子脂质体用于细胞转染的机制在于带正电荷的脂质与带负电荷的细胞膜之间的静电相互作用，从而促进细胞对 siRNA 的吞噬。
在生物相容性和药代动力学方面，由于生物膜带负电荷，阴离子或中性脂质体通常优于阳离子脂质体。一种出色的中性脂质—1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）已被用于提高 siRNA 的包封效率。2005 年，Landen 等人利用 DOPC 开发了一种含靶向癌蛋白 EphA2 的 siRNA 的中性脂质体（siRNA-EphA2-DOPC）。值得注意的是，在将这种 siRNA-EphA2-DOPC 脂质体给药于卵巢癌原位小鼠模型 48 小时后，观察到 EphA2 表达显著下调。目前，siRNA-EphA2-DOPC 正在 M.D. 安德森癌症中心（MDA）进行 I 期临床试验。
尽管阳离子脂质体可能不像其他类型的脂质体那样具有相同的生物相容性，并且容易被单核吞噬细胞系统清除，但其显著的优势在于具有较高的细胞摄取能力。因此，目前阳离子脂质体仍是首选。例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和 1,2-二油酰-3-三甲基丙烷（DOTAP）等阳离子脂质可通过静电相互作用被配制成能有效运输带负电荷的 siRNA 的阳离子脂质体。Sorensen 等人成功地通过 DOTAP 脂质体递送 TNF-αsiRNA，并在败血症小鼠模型中有效抑制了细菌脂多糖（LPS）诱导的死亡。
脂质体的聚乙二醇化是提高药物递送效率的重要方法。通过在脂质体表面涂覆一层聚乙二醇（PEG），可减小颗粒大小，防止储存期间的聚集和融合。此外，聚乙二醇化还能减少单核吞噬细胞系统的清除，并延长脂质体在血液中的半衰期。然而，脂质体聚乙二醇化也存在一些缺点。例如，PEG 的空间位阻效应和负电荷特性会阻碍细胞摄取，降低脂质体与内体膜的融合，并抑制内体逃逸。这些问题可以通过合理设计脂质体表面的 PEG 密度和长度，或者使用 pH 敏感的化学键合 PEG 来解决。尽管最佳的 PEG 密度和长度仍在研究中，但 pH 敏感化学键优化的 PEG 改性已显示出有效性。例如，通过肟键与 PEG 连接的脂质体在 pH 7.4 时保持稳定，但在 pH 值为 5.5 的酸性环境中会加速 siRNA 的释放并提高基因沉默效果。此外，经 HEMA-组氨酸-甲基丙烯酸（HEMA）修饰的聚乙二醇化脂质体在中性条件下表现出稳定性。相比之下，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）脂质体核心带正电荷，进入内体后，在酸性环境中咪唑和甲基丙烯酸残基质子化，使带负电荷的聚乙二醇转变为正电荷。这种解离使带正电荷的脂质体核心暴露出来，促进与内体融合并有助于内体逃逸。
稳定核酸脂质颗粒（SNALPs）是最著名的基于脂质的 siRNA 递送载体。值得注意的是，美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗埃博拉的 siRNA 药物就是通过 SNALPs 递送的，这是一种封装 siRNA 的脂质纳米颗粒，粒径约为 120 纳米。SNALPs 具有脂质双层结构，外层由阳离子脂质和促融合脂质混合组成，而 siRNA 则封装在内层，脂质双层结构的表面修饰有聚乙二醇（PEG）。表面的 PEG 存在使得 SNALPs 能够实现长时间循环，并通过增强的渗透和滞留（EPR）效应在肿瘤部位被动富集。一旦 SNALPs 到达肿瘤部位，它们就能被肿瘤细胞迅速摄取，从而实现高效的 siRNA 递送。Alnylam 制药公司取得了重大突破，将两种 siRNA（VEGF siRNA 和 KSP siRNA）同时封装在 SNALPs 中，将这种制剂命名为 ALN-VSP02。2009 年 4 月，ALN-VSP02 开始用于晚期实体瘤的 I 期临床试验，首批 28 名患者在接受了六种最高剂量（1.25 毫克/千克）的治疗后，表现出良好的耐受性和抗肿瘤活性。值得注意的是，一名子宫内膜癌患者实现了完全缓解。Tekmira 制药公司还开发了 SNALP-Plk1 siRNA（TKM080301），目前正在进行针对各种实体瘤和淋巴瘤的 I 期和 II 期临床试验。此外，Abdel-Bar 等人开发了一种稳定的 SNALP 配方，能够同时递送多柔比星（Dox）和 siCD47，协同增强肿瘤免疫原性细胞死亡（ICD）。优化后的 SNALPs 对 siRNA 和多柔比星的包封率超过 65%，并且血清稳定性得到改善。siCD47 和载有多柔比星的 SNALPs 的组合在肿瘤挑战模型中表现出强大的抗肿瘤活性。
脂质纳米颗粒（LNPs）是由脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成的 siRNA 递送载体，其结构类似于 SNALPs，同样具有脂质双层结构，表面聚乙二醇化，siRNA 封装在核心部位。Akinc 等人开发了一种快速化学合成脂质类似物库的方法，并进行筛选以确定用于 siRNA 递送的最有效脂质类似物纳米颗粒。其中最有前景的脂质类似物纳米颗粒成分之一是 98N12-5，用其封装的 ApoB 或 FVII 因子的 siRNA 在非人灵长类动物肝细胞中可实现 75% – 90% 的基因沉默。
基于聚合物的 siRNA 递送系统
基于聚合物的递送载体，也称为聚合物纳米粒子，是一类常用的固体可生物降解胶体纳米粒子，用于药物递送，主要分为水溶性聚阳离子纳米粒子和聚合物纳米粒子（图 5C）。
目前有多种水溶性聚阳离子纳米颗粒可供选择，包括源自环糊精聚合物（CDP）和聚乙烯亚胺（PEI）的纳米颗粒。其中，CDP纳米颗粒在临床siRNA 药物递送方面展现出巨大潜力。一个显著的例子是由 Calando 制药公司开发的基于 CDP 的 siRNA 药物 CALLA-01。CALLA-01 由四个组分组成：CDP、金刚烷-聚乙二醇（AD-PEG）、金刚烷-聚乙二醇-转铁蛋白（AD-PEG-Tf）和 siRNA。这些组分自组装成纳米颗粒，带正电荷的 CDP 和 siRNA 构成颗粒核心。AD-PEG 的加入在颗粒表面形成聚乙二醇壳层，这增加了颗粒的稳定性，并减少了单核吞噬细胞系统的清除。此外，AD-PEG-Tf 与转铁蛋白偶联，转铁蛋白能特异性结合肿瘤细胞中高表达的转铁蛋白受体 CD71，从而实现靶向药物递送。
该领域中主要使用的聚合物纳米粒子源自聚己内酯（PCL）、聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。一项引人注目的研究报道了一种名为“胶束复合体”的自组装胶束纳米粒子（MNP），它由聚乙二醇-b-聚己内酯)-b-聚（2-(2-氧代-（1,3,2-二氧磷杂环氧）乙基甲基丙烯酸酯（mPEG-b-PCL-b-PPEEA）三嵌段聚合物。171 这种胶束复合物由疏水核心（由 PCL 嵌段形成）、负责与 siRNA 结合的阳离子亲水性磷酸酯 PPEEA 以及稳定颗粒的外层 PEG 层组成。
siRNA-偶联递送系统
siRNA-偶联递送系统涉及将 siRNA 直接与递送材料偶联，从而形成具有特定特性的单一组分药物递送系统。最初将 siRNA 偶联的方法是将其与胆固醇等亲脂性分子偶联。然而，已经开发出了各种偶联系统。这些系统包括将 siRNA 与聚合物、肽、抗体、核酸适配体或小分子偶联（图 5D）。
脂溶性-siRNA 偶联物，其中胆固醇通过吡咯烷酮键连接到 siRNA 有义链的 3′ 端，不仅提高了 siRNA 在体外的转染效率，还改善了 siRNA 在体内的药代动力学。2007 年，Wolfrum 等人研究了利用高密度脂蛋白（HDL）进一步优化胆固醇-siRNA 结合物，使体内 siRNA 基因沉默效果提高了 8 至 15 倍。最近，Masimov 等人开发了与 HDL 共轭的壳聚糖纳米颗粒，以保护 siRNA 免受酶降解。这些纳米颗粒能够靶向表达 SR-B1 受体的肝癌细胞中的 siRNA。此外，抗体-siRNA 耦合递送系统利用抗体的特异性，实现了靶向递送。
细胞穿透肽（CPPs）被用作小干扰 RNA（siRNA）的偶联剂，以促进细胞膜或内体膜的穿越，从而提高 siRNA 的转染效率或内体逃逸。TAT 转录激活蛋白是从 HIV-1 病毒中提取的一种细胞穿透肽。TAT 可以通过磺基琥珀酰亚胺-4-（对马来酰亚胺苯基）丁酸酯和其他杂双功能桥接键偶联到 siRNA 反义链的 3′ 端。这种偶联策略显著提高了 siRNA 的细胞内递送效率。
除了上述的 siRNA 耦合递送系统外，最有前景的临床应用之一是 N-乙酰半乳糖胺 – siRNA（GalNAc – siRNA）耦合递送系统。该系统对肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）具有高亲和力，能够实现 siRNA 的肝靶向。Alnylam 制药公司开发了一种三价 GalNAc – siRNA 递送系统，以增强肝脏靶向能力。已通过将三价 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）分别与转甲状腺素蛋白（TTR）小干扰 RNA（siRNA）、前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（PCSK9）siRNA 或抗凝血酶（AT）siRNA 连接，制备了三种小干扰 RNA 药物，即 ALN-TTRsc、ALNPCS 和 ALN-AT3。这些药物已进入临床试验，用于治疗甲状腺素淀粉样变性、高胆固醇血症和血友病。