顺行性跨突触（Anterograde transsynaptic spread）是指病毒或示踪剂从被感染神经元的胞体出发，沿轴突运输至突触前末梢并跨越突触间隙进入其直接连接的突触后神经元的过程。这一特性使得研究人员能够在神经环路中实现从上游到下游的多级神经元标记从而解析脑内复杂的连接网络。与传统的仅停留在初始感染细胞的示踪方法不同，具有顺行跨突触能力的工具可以“跳跃”一个或多个突触，揭示功能上相连的神经通路。目前，少数几种病毒具备这种能力，其中腺相关病毒1型（AAV1）和单纯疱疹病毒H129株（HSV-H129）是最常用于顺行跨突触示踪的工具。与传统示踪剂或非跨突触AAV血清型相比，AAV1的优势在于其能够在多种神经通路中稳定、高效地进行一级顺行跨突触传播且标记局限于解剖学上直接相连的下游神经元，极少出现沿“路过轴突”的非特异性扩散。因此，可结合转基因小鼠和多种病毒资源，实现神经回路的解剖映射、功能记录与操控。
（1）注射前准备
确定注射策略：明确上游注射区域、下游检测区域、重组酶类型。
（2）立体定位注射
（1）神经元识别与表征
首选方法：转基因报告小鼠：最简便高效，可实现全脑突触后神经元分布检测，
无转基因小鼠时：
免疫染色：检测重组酶，但低表达时可能漏检。
眶后注射 AAV-PHP.eB：50μL 含 1.0×10¹¹ 病毒颗粒，实现全脑标记。
下游区域注射条件性荧光 AAV：提高特定区域检测灵敏度。
（2）轴突输出映射
采用两步病毒注射法：
上游区域注射 AAV1-Cre（或 AAV1-FlpO）。
下游目标区域注射 Cre（或 FlpO）依赖性荧光 AAV。
优势：可精准展示拓扑特异性输入-输出关系。
（3）功能检测
替换荧光 AAV 为功能工具 AAV，实现对输入定义神经元的操控或记录：
关键参数：
病毒滴度：是跨突触传播效率的关键，滴度每降低一个数量级，突触后标记数量成比例减少，需确保≥1.0×10¹³ GC/mL。
2025-10-24
案例部分结果解读：
单步注射：
在双报告小鼠（Frt-GFP×Ai14-tdTomato）中，分别向上肢运动皮层（MOp-ul）注射 AAV1-hSyn-FlpO、向口面部运动皮层（MOp-orf）注射 AAV1-hSyn-Cre，可观察到脑桥核、上丘中 GFP+（FlpO 依赖）和 tdTomato+（Cre 依赖）神经元的拓扑分离分布。
两步注射：
向上游 PSV 核注射 AAV1-Cre，向丘脑 VPM 核注射 AAV1-CAG-FLEX-GFP，可观察到 VPM 神经元特异性表达 GFP，其轴突优先投射至初级体感皮层（SSp-bfd）的 4 层和 5/6 层边界，而 PO 核神经元轴突投射至 1、2/3、5 层，体现拓扑特异性。
Fig1 AAV1进行顺行跨突触神经回路标记
图A中，AAV1 – hSyn – Cre可经轴突运输到下游目标区域，使Ai14 – tdTomato报告基因表达以标记下游细胞，而AAV1 – hSyn – GFP因病毒拷贝数低，驱动的GFP表达难检测；体现出不同 AAV1 载体在标记效率上的差异。
图B-C，在 Ai14 小鼠的初级视觉皮层（V1）共注射 AAV1 – hSyn – GFP 和 AAV1 – hSyn – Cre 后，对脑桥核进行成像。图 C 中可见 GFP 阳性轴突（绿色）和 Cre 阳性 /tdTomato 阳性细胞（红色），说明 AAV1 – Cre 实现了跨突触标记，证明 AAV1 可作为顺行跨突触工具标记下游神经元；
图D-F，在 Ai14×Frt – GFP 小鼠的 V1 区共注射 AAV1 – hSyn – Cre 和 AAV1 – hSyn – Flp，对上丘（SC）进行研究。图 E 成像显示存在 Flp 阳性 / GFP 阳性（绿色等）和 Cre 阳性 / Tom 阳性（红色等）的细胞，图 F 饼图统计了上丘中不同标记细胞的比例（Cre 阳性 / Tom 阳性细胞占 47%、Flp 阳性 / GFP 阳性细胞占 38%，还有 15% 的其他情况），反映出多重组酶系统可用于标记不同来源的下游细胞群体，能同时研究多种上游输入对下游神经回路的影响。
Fig2 AAV1结合不同报告小鼠和病毒工具对神经回路进行研究的六种策略
利用AAV1结合不同报告小鼠和病毒工具，对神经回路进行研究的六种策略：
（策略 1 – 3）：细胞标记策略
策略 1：在Ai14 – tdTomato（Cre报告小鼠）中，注射AAV1 – hSyn – Cre使下游目标区域的细胞表达tdTomato（红色），标记出受上游注射部位神经元输入的下游细胞。
策略 2：在Ai14 – tdTomato×Frt – GFP（同时为Cre和Flp报告小鼠）中，分别注射AAV1 – hSyn – Cre和AAV1 – hSyn – Flp，可标记出受两种不同上游神经元输入的下游细胞（红色为Cre+，绿色为Flp+，还有部分共标记细胞）。
策略 3：在Ai14 – tdTomato×Vgat – Flp×Frt – GFP（Cre、Flp报告且Vgat阳性细胞特定标记的小鼠）中，注射AAV1 – hSyn – Cre，可标记出受上游输入且为Vgat阳性的下游细胞（存在Cre+、Vgat+及共标记细胞）。
（策略 4 – 6）：功能与亚群研究策略
策略 4：在Ai14 – tdTomato小鼠中，先注射AAV1 – hSyn – Cre标记输入定义的细胞，再在下游目标区域注射AAV1 – CAG – FLEX – GFP，通过GFP标记这些细胞的轴突输出，以绘制轴突投射。
策略 5：在Ai14 – tdTomato小鼠中，注射AAV1 – hSyn – Cre标记输入定义细胞，同时在下游目标区域注射AAV1 – hSyn – FLEX – ChR2 – GFP，利用ChR2结合LED光刺激，对这些细胞进行功能检测。
策略 6：在Vgat – Cre×Ai14 – tdTomato小鼠中，注射AAV1 – EF1a – DIO – Flp，使Vgat – Cre阳性细胞表达Flp，再在下游目标区域注射AAV1 – EF1a – fDIO – YFP，标记出Vgat阳性且受上游输入的细胞的轴突输出，从而研究基因定义的神经元亚群。