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结果：
SMC4 是 HCC 预后独立的预后因子
为探讨 SMC4 在 HCC 中的作用，分析了GSE14520 数据集中的基因表达数据。该数据集包含肿瘤组织和非肿瘤组织配对。在移除 TNM 阶段信息不完整的样本后，共对 219 个样本进行了 Cox 分析和生存预后曲线分析，使用 Kaplan-Meier 绘图仪（图）。S1）。对 OS 和 RFS 的单变量 Cox 回归分析显示，TNM 阶段（P < 0.01）与 SMC4（P < 0.05）之间存在强烈相关性，而 HCC 预后较差（见图）。S1 1 A， C）。所有在单变量分析中表现出统计显著性的变量均被纳入多元 Cox 回归模型。多元 Cox 回归分析对 OS 和 RFS 还确认 TNM 阶段（P < 0.01）和 SMC4（P < 0.05）为 OS 和 RFS 的独立预后因子（见图）。第一季B，D）。此外，采用 Kaplan-Meier 曲线分析评估风险评分对高细胞癌患者 OS 和 RFS 的影响，显示 SMC4 表达水平与 OS 和 RFS 之间呈负相关（图）。第一季E 和 F）。
为进一步验证这些结果，作者使用 TCGA-LIHC 数据集对 SMC4 表达进行了更详细的分析，该数据集共计 372 个样本（见图）。第二季）。与 GSE14520 数据集的发现一致，作者观察到 SMC4 表达与 HCC 预后之间存在显著关联。USP39/SMC4 在 HCC 预后中的重要性
在GSE14520 数据集中的肿瘤组织样本（219 个样本）中，使用皮尔逊相关分析研究 SMC4 表达与其他基因之间的关系（|cor| >= 0.3，P < 0.05）。 共有 1,141 个基因与 SMC4 表达呈正相关。随后通过基因本体论（GO）进行功能富集分析，识别出十二条显著通路，并以气泡图形式可视化（图 1A）。此外，GSEA 对 GSE14520 数据集中的 219 个肿瘤样本进行了评估，并使用 Limma 程序评估了 SMC4 的表达差异（分为高和低）。基因功能富集分析使用 clusterProfiler 软件包（GSEA 程序）进行。GSEA 结果显示，高 SMC4 表达与蛋白质-DNA 复合体亚基组织、蛋白质去泛素化及通过小蛋白去除实现的蛋白质修饰之间存在正相关（图 1A）。
USP39/SMC4 可能在 HCC 预后中起到了重要作用。（A）基因组的 GOBP 分析与 SMC4 呈正相关（左图）;GSEA 对该基因组的分析与 SMC4 相关（右图）。（B）HCC 中 SMC4/USP39 蛋白的 Wilcoxon 分析（左图）;还采用 Wilcoxon 分析研究 SMC4/USP39 表达与 HCC 分期之间的关系（右图）。（C）Kaplan-Meier 研究 SMC4/USP39 表达与 OS/RFS 之间的关系。（D） SMC4 蛋白表达与 USP39 的相关性分析（样本分为正常对照组（正常）、肿瘤组（TNM I-II 期）、肿瘤组（TNM III-IV 期）。（OS，整体生存;RFS，无复发生存;GOBP，基因本体生物学过程）。
进一步的 GOBP 和 GSEA 分析GSE14520 数据集中与 SMC4 表达相关的基因，显示 USP 蛋白去泛素酶家族（USP1、USP3、USP13、USP15、USP33、USP39、USP46）富集。这些 USP 蛋白在 GOBP 中显著富集（GO：0016579，GO：0070646），并在 GSEA 分析中显著上调（GO：0070646）。此外，作者进行了 CHCC-HBV 分析，结果显示只有 USP39 蛋白水平在 HCC 中上调。为进一步探讨 SMC4 与 USP39 之间的关系，作者采用 Wilcoxon 检验并进行 Bonferroni 校正，发现 SMC4/USP39 高表达与 HCC 晚期肿瘤分期有强烈关联（见图 1B）。
此外，作者研究了 CHCC-HBV 队列中 SMC4 的表达，并在 159 对 HCC 和副癌组织中进行了配对蛋白质组检测。结果显示，HCC 样本中的 SMC4 表达有所增加。这种升高的表达与缩短的 OS 和 RFS 相关（见图）。1 同时，作者使用 Kaplan-Meier 方法评估了 CHCC-HBV 队列中 USP39 在 HCC 患者中的预后显著性（见图 1C）。患者根据 USP39 表达的中位数被分为高组和低组。高 USP39 表达组的 OS 和 RFS 表现显著比低表达组更严重。皮尔逊相关系数分析显示 SMC4 与 USP39 表达水平呈正相关（见图 1D），结果表明两者在正常样本和肿瘤样本中均呈正相关，尤其是相关系数较高的肿瘤样本（TNM I-II， R = 0.55， p = 8.8 × 10–10;TNM III-IV，R = 0.53，P = 3.3 × 10−5）。USP39 /SMC4 在 HCC 中显著表达
为验证生物信息学分析结果，作者采集了十对 HCC 组织及邻近的副癌组织。使用 qPCR 和西方墨迹分析了 HCC 组织中 USP39 和 SMC4 的表达水平。结果显示，与副癌组织相比，HCC 组织中 USP39 和 SMC4 的表达水平显著提升（见图。2 此外，多个肝癌细胞系（97-H、HCCC-9810、Bel-7405、HepG2、Hep3B、LM3、HuH-7）中 USP39 和 SMC4 的表达水平（见图 2B）。基于 SMC4 和 USP39 的高表达，作者选择了 HepG2 细胞进行进一步研究。进行了免疫组化以检查 USP39 和 SMC4 的表达和定位。结果显示，HCC 组织中 USP39 和 SMC4 均显著增加，SMC4 在细胞核和细胞质中均有分布，主要定位于细胞核，而 USP39 主要定位于细胞质。（图 2C）
USP39 /SMC4 在 HCC 中显著表达。（A）进行了西方印迹和 qPCR 分析 HCC 组织中 SMC4/USP39 水平。（B）进行了西方墨迹和 qPCR 分析肝细胞系（1,97-H;2，HCCC − 9810;3，贝尔-7405;4，肝炎 2;5，肝炎 3B 型;6，LM3;7，HuH-7）。（C）免疫组化还用于检测 USP39/SMC4 在 HCC 组织中的表达水平和定位（×400）。（数据显示为平均 ± SD;*** P < 0.001;比例尺：50 微米）。USP39/SMC4 在促进 HepG2 细胞存活率和增殖中的重要性
作者进行了一系列实验，探讨 USP39 和 SMC4 在 HCC 中的功能作用。最初，USP39-siRNA 转染到 HepG2 细胞中，并通过 qPCR 评估 USP39 和 SMC4 的表达水平。研究结果显示，尽管 USP39 干扰 SMC4 表达保持不变（见图。3A）。进一步，作者利用共免疫沉淀分析研究了 USP39 与 SMC4 之间的相互作用，以及 SMC4 的泛素化状态（见图 3B）。结果显示 USP39 与 SMC4 之间存在结合相互作用，与对照组相比，USP39-siRNA 组的 SMC4 蛋白水平显著下降。这一下降归因于 USP39-siRNA 的引入，导致 SMC4 泛素化增加，进而 SMC4 蛋白水平下降。为进一步验证 USP39 的作用，在 HepG2 细胞中进行了蛋白质稳定性测定，证明 USP39-siRNA 加速了 SMC4 蛋白的降解（见图 3C）。随后，通过 MTT、EdU 和刮痕分析评估了 HepG2 细胞的存活率和增殖情况。与对照组相比，USP39-siRNA 组的肝活率、增殖率和运动性显著降低，该组抑制了 USP39（见图 3D，E）。这些发现表明，USP39 在维持 SMC4 稳定性方面发挥着关键作用，通过促进泛素的去除，从而促进 HepG2 细胞的存活和增殖。
USP39 可能调控 SMC4 的去泛素化，影响细胞增殖和存活能力。（A）在 USP39 被敲低后，进行了 qPCR 检测 USP39 和 SMC4 的表达。（B）通过共免疫沉淀法研究 USP39 与 SMC4 之间的关系及 SMC4 的泛素化水平。（A，肝炎 G2;B，HepG2 + 载体;C，HepG2 + USP39-siRNA）。（C）蛋白质稳定性分析旨在评估 USP39 敲低后 SMC4 蛋白的稳定性。采用 MTT（D）、刮痕法和 EdU（E）检测 USP39 敲低后 HepG2 的存活性和增殖情况。（数据显示为平均 ± SD;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001;比例尺条：50 微米）
在肝炎 G2 细胞中，使用 USP39-siRNA 以及 SMC4-overexpressionOE 或 SMC4-siRNA 进行共染色实验，以进一步探讨对细胞表型的影响。进行了 qPCR 和西方印迹法以验证基因沉默和过表达的有效性。如图所示。4 答：当 USP39 被敲低后，SMC4 基因表达保持不变，但 SMC4 蛋白水平下降。在 USP39-siRNA 和 SMC4-OE 共转染后，USP39 表达显著降低，而 SMC4 表达在基因和蛋白质水平均恢复。进行了 MTT、EdU 和刮除法以评估细胞的存活性和增殖。在图 4B-C 中，USP39 或 SMC4 被抑制，HepG2 细胞的存活率和增殖率降低。然而，在 USP39-siRNA+SMC4-OE 组中，USP39 被抑制，SMC4 被过度表达，细胞的存活能力和增殖得到了部分恢复。这些结果强调了 USP39/SMC4 轴在提升肝炎 G2 细胞存活率和增殖中的关键作用。
USP39/SMC4 有望促进 HepG2 细胞的存活率和增殖。在 HepG2 细胞中，使用 USP39-siRNA 和 SMC4-overexpression（OE）或 SMC4-siRNA 进行共转染实验，以研究细胞表型的变化。（A）分别进行了 qPCR 和西方印迹法分析干扰后 USP39 和 SMC4 的表达。分别采用 MTT（B）、Scratch 测定和 EdU（C）检测 HepG2 在 USP39 和 SMC4 干扰后的增殖和存活情况。（数据显示为平均 ± SD;* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001;比例条：50 微米）SMC4 对 HCC 增殖的影响可能由 TIAL1/ZNF207 介导
GSE14520 数据集中的肿瘤组织样本通过单变量 Cox 回归分析，以识别与 RFS 高度相关的基因（n = 2552，P < 0.05）。 维恩分析显示共有 181 个基因与 SMC4 呈正相关，并对 RFS 具有显著预测价值。随后对 181 个基因进行了 LASSO 回归分析，识别出 24 个基因（λ = 24）（见图 S3A）。此外，还进行了多元 Cox 回归分析，利用 R（生存）包构建风险模型（见图 S3A）。模型中选定了七个最优基因（TIAL1、XPO1、ZNF207、STAT1、TBCCD1、LIMS1 和 ATAD2）。此外，风险评分范围为−2.49 至 2.25，AIC 为 0.73，p 值为 1.23×10–13（见图 S3B）。低风险组和高风险组根据中位数分界线进行了分类。Kaplan-Meier 分析对 GSE14520 和 TCGA-LIHC 数据集进行了分析，显示高风险组的 OS 和 RFS 较低风险组更短（见图 S3C）。风险评分分析显示，高风险组的死亡率更高，生存期较短（见图 S3D）。根据使用 GSE14520 数据集进行的 LASSO 回归和多变量 Cox 分析结果，TIAL1、ZNF207、LIMS1 和 ATAD2 被确定为风险基因，而 XPO1、STAT1 和 TBCCD1 则表现出保护作用。
Kaplan-Meier 分析进一步显示，ZNF207、TIAL1 和 LIMS1、ATAD2（未显示数据）高表达与 HCC 预后不良相关（见图 S4A）。此外，CHCC-HBV 队列验证证实，ZNF207 和 TIAL1 在 HCC 中表达较高（见图 S4B），而 LIMS1 表达较低。在 HCC 组与正常组之间未观察到 ATAD2 表达差异。皮尔逊相关分析还显示 SMC4 与 ZNF207（TIAL1）呈正相关，暗示 SMC4 可能调控 HCC 通过 ZNF207 和 TIAL1 的进展（见图 S4C）。
为研究 SMC4 与 ZNF207 之间的关系，进行了 TIAL1、qPCR 和西方印迹法（见图）。5A）发现 SMC4 与 TIAL1 之间表达呈正相关，SMC4 水平上升时 TIAL1 表达增加，SMC4 表达减少则减少。相比之下，ZNF207 表达不受 SMC4 表达变化的影响。这些发现表明 SMC4 可能调控 TIAL1 的基因和蛋白质水平表达，但不调控 ZNF207 的表达。为进一步探讨功能变化，HepG2 细胞接受 SMC4 上调，并结合敲低 TIAL1 或 ZNF207。采用 qPCR 和西方印迹法验证基因干扰的影响（见图 5B）。进行了 MTT、EdU 和细胞刮擦测定以评估 HepG2 细胞的增殖和存活能力（见图 5C-D）。结果表明，SMC4 的过度表达显著增强了 HepG2 细胞（HepG2 + SMC4-OE）的存活率和增殖率。相反，结合 TIAL1 或 ZNF207 敲低时，肝炎 G2 细胞的存活率和增殖率显著降低。这些结果表明，SMC4 与 TIAL1 和 ZNF207 共同促进 HepG2 细胞的增殖和存活能力。
SMC4 调控 TIAL1 的表达，影响细胞表型。（A）通过 qPCR 和西方印迹法观察到了 SMC4 与 ZNF207、TIAL1 之间的关系。（B）分别采用西方墨迹法和 qPCR 测定法检测 SMC4 过表达与 ZNF207 或 TIAL1 敲低后表达水平的变化。采用 MTT（C）、EdU 和 Scratch （D）检测 HepG2 在 SMC4 过表达与 ZNF207 或 TIAL1 敲低后 HepG2 的增殖和存活能力。（数据显示为平均 ± SD;* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001;比例尺条：50 微米）SMC4 可能通过 TIAL1 和 ZNF207 调控肝癌细胞系的耐药性
R 软件包（oncoPredict）用于基于GSE14520 和 TCGA-LIHC 数据集预测 IC50。模型根据中位风险评分分为低风险组和高风险组。结果表明，SMC4 表达较高与 GSE14520 和 TCGA-LIHC 数据集 IC50 值升高相关，表明该组肝细胞对 5-FU 表现出更强抵抗力（见图 S5A-D）。
作者选择了表现出最高 SMC4 表达的 HepG2 细胞来生成耐药细胞。MTT 检测用于评估肝炎 G2 细胞的存活率，计算了 IC50 值（723.083nM），当细胞增殖抑制达到 50%时（见图）。6 随后，这些 HepG2 细胞暴露于确定的浓度下，形成耐药细胞，称为 HepG2/5-FU。进行了 MTT 和 EdU 检测，以评估在 SMC4 过表达及暴露于 5-FU（IC50,723.083nM） 2 小时后 HepG2 细胞的存活率和增殖情况（见图 6B 和 C）。该组（HepG2 + vector）作为对照组。在（HepG2 + SMC4-OE）组中，SMC4 过表达为特征，HepG2 细胞表现出药物敏感性降低，细胞存活率和增殖率均较（HepG2+载体）高。在（HepG2 + SMC4-OE + ZNF207-siRNA）和（HepG2 + SMC4-OE + TIAL1-siRNA）组中，SMC4 过表达与 TIAL1 或 ZNF207 的降级结合。这些干预部分恢复了药物敏感性，并抑制了 HepG2 细胞的存活率和增殖。
.SMC4 可能通过 TIAL1 和 ZNF207 调控肝癌细胞系的耐药性。（A） HepG2 的 IC50 值通过 MTT 检测法计算。（B）MTT 用于检测 SMC4 过表达与 ZNF207 或 TIAL1 敲低后 HepG2 增殖的情况。（C）EdU 用于检测 SMC4 过表达与 ZNF207 或 TIAL1 敲低后 HepG2 增殖。（D）应用 MTT 检测 SMC4、ZNF207 和 TIAL1 敲低后 HepG2/5-FU 的增生。（E）EdU 用于检测 SMC4、ZNF207 和 TIAL1 敲低后 HepG2/5-FU 的增殖。（数据显示为平均 ± SD;* P < 0.05，**P < 0.01，*** P < 0.001;比例条：50 微米）
此外，还进行了 MTT 和 EdU 检测，分别评估了在敲低 SMC4、TIAL1 和 ZNF207 后 HepG2/5-FU 细胞的存活率和增殖情况（见图）。6D 和 E）。（HepG2）和（HepG2/5-FU）组作为对照组。结果表明，HepG2/5-FU 细胞在 SMC4 敲低后，在（HepG2/5-FU + SMC4-siRNA）组中重新获得对 5-FU 的敏感性。同样，在（HepG2/5-FU + ZNF207-siRNA）和（HepG2/5-FU + TIAL1-siRNA）组中，敲低 TIAL1 或 ZNF207 恢复了 HepG2/5-FU 细胞中的 5-FU 敏感性，抑制了细胞的存活和增殖。这些发现表明，SMC4 通过与 TIAL1 和 ZNF207 的相互作用，在调控肝癌细胞系的耐药性中发挥关键作用。
总结
作者的研究为 USP39 在 SMC4 脱泛素化修饰中的重要作用提供了宝贵见解，该修饰有助于维持蛋白质水平。此外，作者提供了证据表明 SMC4 可能通过 TIAL1 和 ZNF207 途径促进肝癌细胞的增殖和耐药性。这些发现为 HCC 患者，尤其是 SMC4 表达水平升高的患者，提供了潜在的治疗靶点。
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