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2-（4-（（（6,7-双（2-甲氧基乙氧基）喹唑啉-4-基）氨基）甲基）-1 H-1,2,3-三唑-1-基）-N-（4-氯苯基）乙酰胺 9（4-TCPA） 通过高效、多步合成路线制备，如图 所示 1 。 最初，4-氯-6,7-双（2-甲氧基乙氧基）喹唑啉 6 在三乙胺 （Et3N） 存在下与炔丙基胺 7 进行亲核芳香族取代 （SNAr），产生 6,7-双（2-甲氧基乙氧基）-N-（prop-2-yn-1-基）喹唑啉-4-胺 8。另一方面，2-叠氮基-N-（4-氯苯基）乙酰胺 5 是使用作者之前的工作 27 中报道的程序制备的。 最后，在室温下，在 CuSO4.5H 2 O 和抗坏血酸钠的 DMF 存在下，与乙炔衍生物 8 进行咔嗒反应过夜，形成靶向化合物 9（4-TCPA）。 使用 1H-NMR 确认了该化合物的结构（图。 S1 ）、13C-NMR（图。 S2 ）光谱以及高分辨率质谱（HRMS）（图。 S3 ）。
反应条件和试剂：（a）氯乙酰氯 2（1.2 当量），Et3N（1.2 当量），丙酮，r.t.，过夜;（b） NaN34 （1.5 当量），DMF，r.t.，过夜;（c）炔丙胺 7（1.3 当量），Et3N（1.3 当量），DMF，80 °C，12h;（d）CuSO4.5H 2O（0.3 当量），抗坏血酸钠（0.3 当量），DMF，r.t.，过夜。
含有1,2,3-三唑衍生物的喹唑啉对细胞活力的影响
为了确定含有 1,2,3-三唑衍生物（4-TCPA） 的喹唑啉对癌细胞增殖和活力的影响，将 1×10 个 4 个细胞/孔置于不同浓度（0–200 μM）的衍生物中 72 h，并采用比色 MTT 试验检测细胞毒性。结果表明细胞系的活力和增殖在剂量和时间上依赖性降低。汇编了暴露 72 小时后化合物的 IC50 浓度。测试了合成化合物抑制不同癌细胞系生长的能力，结果以 IC50 浓度表示。相关癌细胞系是有目的地从多种癌症来源中选择的，例如 A549（肺癌）、MCF7（乳腺癌）、K562（白血病）和正常人包皮成纤维细胞 （HFF2）。4-TCPA 具有效力，IC50 浓度分别为 35.70 μM、19.50 μM、5.95 μM 和 135.2 μM，对 A549、MCF7、K562 和 HFF2（图 a-d 2 ）。研究表明，与厄洛替尼相比，4-TCPA 在对癌细胞系产生细胞毒性作用方面表现出近两倍的活性。此外，在 MTT 测定中使用正常人包皮成纤维细胞（HFF2）来评估活性化合物对癌细胞的选择性。将癌细胞与正常 HFF2 细胞系进行比较时，该化学品没有显示出明显的作用。4-TCPA 对常规 HFF2 细胞系有一定危害。一般来说，1,2,3-三唑有助于提高对癌细胞系的抗增殖活性。
4-TCPA 和厄洛替尼（作为阳性对照）对 A549（a），MCF7（b），K562（c）和 HFF2（d）细胞系的细胞毒性诱导。在 72 小时内将该化学品以不同浓度（0–200μg/mL）施加到细胞中。数据反映了三项独立研究的平均值加标准差（SD）。通过将每组与其对照组进行对比，发现了 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001 的值。
按照制造商的指示，膜联蛋白 V/PI 双标记用于测量 A549、MCF7 和 K562 细胞的细胞凋亡率。在细胞暴露于该化合物的 IC50 浓度后，使用流式细胞术寻找细胞灭亡的迹象。结果表明，所有细胞系的早期和晚期细胞凋亡都随时间显着增加（图 3 A）。当所有细胞都用 4-TCPA 处理时，72 小时后，与未处理的细胞相比，超过 40%的处理细胞发生了细胞凋亡，但与未处理的细胞相比，不到 40%的处理细胞的 A549 细胞系发生了细胞凋亡（图 B 3 ）。然而，用厄洛替尼（作为阳性对照）暴露 72 小时的 A549，MCF7 和 K562 细胞，细胞凋亡分别仅增加 12.5%，61.87%和 64.03%[图 3 A，B]。
对用4-TCPA 和厄洛替尼（作为阳性对照）处理的 A549、MCF7 和 K562 细胞进行定量膜联蛋白 V/PI 双染色试验，以测量细胞凋亡。（A）根据流式细胞术分析，4-TCPA 以剂量和时间依赖性方式引起 A549（a，b，c），MCF7（d，e，f）和 K562（g，h，i）细胞凋亡。（B）该图显示了 4-TCPA 处理后数据 A549（a），MCF7（b）和 K562（c）的统计量化。使用流式细胞术进行细胞凋亡分析显示，早期和晚期凋亡细胞的时间和剂量依赖性增加。数据反映了三项独立研究的平均值加标准差（SD）。将每组与其对照进行比较，得出 ***p < ****p < 0.0001。
利用分光光度法评估半胱天冬酶 3/7 的酶活性作为细胞凋亡的标志物，以验证细胞凋亡的存在。与未处理的对照细胞和阳性对照（厄洛替尼）相比，4-TCPA 处理（IC50 浓度）在 A549，MCF7 和 K562 细胞中以时间依赖性方式持续增加半胱天冬酶 3/7 的活性。处理 72 小时后，A549 细胞的增加分别为 0.21 mU/mL（图 a 4 ），MCF7 细胞的增加为 0.86 mU/mL（图 b 4 ），K562 细胞的增加为 0.93 mU/mL（图 c 4 ）。这些结果证实了定性和定量细胞凋亡研究的结果，表明癌细胞更早地增强了细胞凋亡。
半胱天冬酶 3/7 酶活性的评估。如材料和方法中所述，在指定时间点（72h）暴露于4-TCPA 后，在 A549（a），MCF7（b）和 K562（c）细胞系中评估了 caspase 3/7 的激活。图表示处理细胞相对于未处理组和阳性对照（厄洛替尼）的半胱天冬酶 3/7 酶活性 （mU/mL）。结果表示为平均值 ± SD （n = 3） （****p < 0.0001 （A549）、**p < 0.0013 （MCF7）、**p < 0.0023 （K562）） 与阳性对照。
使用 qRTPCR 测定基因 Akt、mTOR、MAPK-1、PIK3CA、EGFR 和 VEGFR2 的表达水平，以确定线粒体与细胞死亡有关的过程。在 A549、MCF7 和 K562 细胞中处理 72 小时后，结果表明，IC50 浓度的 4-TCPA 分别诱导 mRNA 水平显着下调（图）。 5 结果表明，与对照组相比，A549 细胞系的 EGFR 和 VEGFR2 表达水平明显较低，mTOR 表达水平也较低，但不如 EGFR 和 VEGFR2。与对照组相比，Akt、MAPK-1 和 PIK3CA 表达水平的下降幅度没有其他基因那么大（图 a 5 ）。与对照组相比，MCF7 细胞系的 mTOR、MAPK-1、EGFR 和 VEGFR2 表达水平明显较低，PIK3CA 表达水平也较低，但不如 EGFR 和 VEGFR2。与对照组相比，Akt 的表达水平没有像其他基因那样下降（图 5 b）。与对照组相比，K562 细胞系的 Akt、mTOR、EGFR 和 VEGFR2 表达水平明显较低，MAPK-1 表达水平也较低，但不如 EGFR 和 VEGFR2。与对照组相比，PIK3CA 的表达水平没有其他基因下降那么多（图 c 5 ）。这些发现表明，4-TCPA 以不同的敏感性激活线粒体途径，导致所有细胞系的细胞凋亡死亡。这些结果验证了 A549、MCF7 和 K562 细胞中的 qRT-PCR 结果。
4-TCPA 暴露后 mRNA 表达水平的测量。在指定时间，用 A549（a）、MCF7（b）、K562（c）细胞处理浓度为 IC50 的 4-TCPA。qRT-PCR 检测 Akt、mTOR、MAPK、PIK3CA、EGFR 和 VEGFR2 转录水平的变化。图表示处理细胞相对于对照 （B2M） 的 Akt、mTOR、MAPK、PIK3CA、EGFR 和 VEGFR2 表达水平。研究结果以平均标准差 （n = 3） 表示;（****p < 0.0001 （A549）、（MCF7） 和 （K562） VEGFR2） 与对照。
总结
总之，这项研究确定了一种新型的含喹唑啉的 1,2,3-三唑化合物，在多个细胞系中具有良好的抗癌活性。4-TCPA 诱导细胞死亡和细胞周期停滞，可能是通过抑制 VEGFR2 和 EGFR 信号传导，并对 mTOR 通路产生额外影响。这些发现为进一步开发该化合物类别作为潜在的癌症治疗药物提供了强有力的理由。未来的体内研究和机制阐明将是推动这一有希望的线索走向潜在临床应用的关键下一步。
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