为了研究 ADSC 和 T24 细胞共培养后细胞的形态变化，作者用 GFP 转染 ADSCs，用 RFP 转染 T24 细胞。在共培养的第三天，T24 细胞表现出圆形或椭圆形的形态，而 ADSC 表现出穿梭或纺锤形。随着培养期的增加，T24 细胞在第 7 天迅速增殖，肿瘤细胞周围有 ADSCs。到共培养的第 14 天，肿瘤细胞继续快速增殖，导致细胞簇大小显着增加，其特征是位于簇中心的不规则肿瘤细胞。干细胞粘附在这些肿瘤簇的表面，在它们之间形成网络状连接。随着时间的推移，干细胞的存在减少，可能表明它们转化为 CAF，并伴随着肿瘤块内干细胞浸润的减少（图 11A).
ADSCs 促进 T24 细胞增殖、集落形成、侵袭和转移，但抑制细胞凋亡。
接下来，作者评估了细胞活性，证明混合比例组的细胞活力增长率大于 CM、T24 和 ADSC 组，其中 10：1 混合组的增加最为显着。为了进一步研究共培养后 T24 细胞特性的改变，作者利用含有嘌呤霉素抗性基因的 T24（T24puro +）细胞与正常 ADSC 进行共培养。在培养的第 14 天，作者将 3μg/mL 嘌呤霉素添加到培养基中（在此浓度下，所有 ADSC 都已死亡，如图 S2 所示）以消除 ADSC 并获得共培养的 T24 细胞，称为 COC 组。与野生型 T24 细胞相比，COC 组的 T24 细胞表现出多边形或纺锤形生长，假足数量增加（图 1R）。在混合培养物（图 1B）和与 ADSC 共培养后的 T24 细胞（图 1C）中，这些细胞的增殖能力均大于 T24 组，其中 10：1-COC 组和 10：1 共培养组之间观察到最明显的差异。在 5637 和 UM-UC-3 细胞系中也获得了一致的结果（图 S6），而排除了 ADSC 培养基对 T24 增殖的影响（图 S7）。
在蛋白质表达方面，与 T24 和 CM 组相比，细胞周期相关蛋白 CDK2、CDK6 和细胞周期蛋白 B1 上调，而细胞周期抑制剂 P21 和 P27-KIP 显著下调（图 1）。1D-I）。此外，细胞凋亡蛋白 Bax、caspase-9 和 caspase-3 的表达降低，而抗凋亡蛋白 BCL-2 的表达增加（图 1J-N）。此外，COC 组的菌落形成以及细胞侵袭和迁移显着增强（图 1O-Q，图 1。S3）。膜联蛋白 V/PI 双染色、Hoechst 核染色和 ROS 测定分别显示细胞灭亡率降低、核碎裂减少和 ROS 表达降低（图 S4）。共培养后，T24 细胞形态发生显着改变，其特征是多边形或纺锤形生长，细胞拉长，伪足数量增加，并有上皮样转化的趋势（图 1 R）。因此，作者假设 ADSC 在 T24 BLCA 细胞中起功能获得作用。基于这些实验结果，作者选择了 10：1-COC 组进行后续验证实验。
A 为细胞增殖形态图，红色为 T24 细胞，绿色为 ADSCs，BF 为明场;B 为 T24 组、CM 组和各混合培养组（10：1-共培养组、3：1-共培养组和 1：1-共培养组）的细胞增殖曲线;C 分别为 T24 组、CM 组和 T24 组（10：1-COC 组、3：1-COC 组和 1：1-COC 组）共培养后的细胞增殖曲线。D-I 为细胞增殖相关蛋白（CDK2、CDK6 和细胞周期蛋白 B1）和细胞周期抑制蛋白（P21 和 P27-KIP）的表达及其柱状统计结果;J-N 是细胞死亡和抗细胞凋亡相关蛋白（Bax、caspase9、caspase3 和 BCL-2）的表达及其柱状统计结果;O-Q 分别为共培养后 T24 细胞的克隆形成、迁移和侵袭柱状统计分析图;R 为共培养前后 T24 细胞的形态比较，COC 为共培养后 T24 的形态，细胞呈细长形状。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001，n = 3.Bar 值为 50 μm。
为了进一步阐明 ADSCs 影响 T24 细胞的信号通路，作者进行了 mRNA 转录组测序。结果显示，共培养（10：1-COC）组显著富集了许多与 PI3K-AKT 信号通路相关的基因，以及与细胞周期、膀胱癌、细胞死亡、Hippo 信号、MAPK 信号、TGF-β、Wnt/β-catenin 和 P53 相关的通路（图。阿拉伯数字这些途径中的每一种都与细胞增殖、干性、EMT 和耐药性等基本过程密切相关。特异性 EMT 调节通过多种信号通路发生，包括 TGF-β、Wnt/β-连环蛋白、Hedgehog 和 Notch 通路。这些途径刺激转录因子的激活，例如 Snail、Slug 和 ZEB1/221。
mRNA 转录组测序分析和 EMT 相关蛋白表达。A 是 KEGG 通路富集气泡图;B 为 VENN 图，即细胞周期通路、细胞凋亡通路、P53 通路和膀胱癌通路的基因交集分析;C 为细胞周期通路和膀胱癌通路及其共变基因集（共 11 个基因）交集分析的 VENN 图;D-H 是 EMT 相关蛋白（蜗牛、蛞蝓、N-cad 和 E-cad）的表达及其直方图统计分析结果。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， n = 3.
此外，作者通过维恩图对细胞周期、BLCA、细胞死亡和 P53 通路的分析表明，共有 11 个与细胞周期和 BLCA 相关的基因集与细胞增殖有关，其中 P53 基因在四个基因集中共同富集（图 1）。阿拉伯数字BC）。先前的研究表明，几乎所有 MIBLCA 病例都会导致由 TP53，RB1 和/或 ATM 突变驱动的细胞周期检查点的缺失，以及影响其调节因子的改变（例如，E2F3 和 MDM2 表达）8,10。因此，作者专注于 CDKN1A、MDM2 和 P53，以研究共培养是否影响这些基因的表达。
作者随后检查了 EMT 途径。作者的研究结果表明，ADSCs 通过细胞-细胞直接接触上调蜗牛、蛞蝓和 N-钙粘蛋白，但下调 E-钙粘蛋白，从而诱导 T24 细胞中的 EMT（图。阿拉伯数字D-H）。这些发现表明，共培养导致 T24 细胞的表观遗传修饰，从而导致 EMT 重塑和细胞形态改变（图 1 R）。这些基因在 COC 组中表达显著增加，表明存在于微环境中的 ADSCs 具有促进 BLCA 细胞发生 EMT 倾向的潜力。
ADSC 通过 MDM24 调节 T24 细胞的迁移和侵袭能力 2
MDM2 被认为是各种肿瘤预后不良的标志物，其过表达与 BLCA22 的生长和迁移有关。在这项研究中，作者评估了 MDM2 在共培养后 T24 细胞增殖和转移中的作用。作者的分析表明，通过 qRTu2012PCR 和蛋白质印迹法测定，COC 组 MDM2 的 mRNA 和蛋白表达水平显著高于 T24 和 CM 组（图 3 A-C）。
ADSCs 通过 MDM2 调节 T24 细胞的迁移和侵袭能力。A-C 是分析每个细胞群中的 MDM2 基因 mRNA 和蛋白质表达;D-E 是 10：1-COC 组添加抑制剂 Nutlin-3 浓度为 10μM 后 MDM2 蛋白的相对表达;F 是 10：1-COC 组分别添加 2μM Nutlin-3 和 10μM Nutlin-3 后细胞在 24 h 和 48 h 时的增殖活性;G-H 是 10：1-COC 组在添加 10μM Nutlin-3 与 T24 组之前和之后的细胞侵袭的比较;I-J 是 10：1-COC 组在添加 10 μM Nutlin-3 与 T24 组在 12 小时和 24 小时时细胞迁移的比较。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3。
为了进一步研究细胞功能，作者通过抑制剂 Nutlin-3 抑制 MDM2。2μM Nutlin-3 未改变细胞状态;而细胞的增殖能力在 10 μM Nutlin-3 时显著降低。因此，作者选择 10μM 浓度作为实验浓度。用 10 μM Nutlin-3 处理有效地否定了 ADSC 对 MDM2 蛋白表达的上调作用（图。3、D-E），以及 T24 细胞增殖（图 3F），侵袭和 T24-COC 组引起的迁移（图 3 G-K）。MDM2 是肿瘤抑制因子 TP53 的关键负调节因子，其主要作用是通过 TP53 依赖性途径抑制细胞周期停滞和细胞灭亡。MDM2 的致癌作用主要归因于其阻碍 TP53 转录活性的能力。然而，最近的研究结果表明，MDM2 还通过 TP53 非依赖性机制调节促进肿瘤发生的多种信号通路，这些机制与不良临床结果相关 23。这项研究进一步表明，ADSCs 通过调节 MDM2 促进 T24 细胞的增殖、侵袭和迁移。
ADSCs 促进 T24 细胞中 PD-L1 的表达，调节肿瘤细胞干性
膀胱癌干细胞（BCSC） 代表了一个独特的细胞亚群，其特征是高致瘤性、耐药性和转移性，所有这些都对 BLCA24 的发展、转移和复发至关重要。目前，人类 BCSC 的遗传基础和起源仍然未知。被鉴定为与肿瘤干细胞相关的表面分子包括 CD133 和 CD44，干细胞干性相关基因包括 NANOG、OCT4 和 SOX225,26，其中 PD-L1 表达被注意到可以增强肿瘤干细胞特征。在这项研究中，作者旨在研究与 ADSC 共培养后 T24 细胞干性的变化。作者对肿瘤干细胞相关基因和蛋白质的评估表明，与 T24 组相比，COC 组的 NANOG、OCT4 和 CD44 的 mRNA 和蛋白水平显着升高（图 4 A-E）。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）进行转录组分析显示，CD274（PD-L1）在 COC 组中明显上调，促使作者在 10：1-COC 组中验证这些发现。作者发现 10：1-COC 组的 PD-L1 表达大约是 T24 组的五倍（图 4F-H）。为了进一步研究 PD-L1 对干性的影响，作者引入了一种 PD-L1 阻滞剂 Atezo，它以其抑制 PD-L1 的有效性而闻名。作者的实验表明，Atezo 以剂量依赖性方式显着抑制 10：1-COC 细胞的增殖。具体而言，10：1-COC 细胞形成的菌落数量在 Atezo 浓度为 5μg /mL 时关闭至一半，在 20μg /mL 时几乎消除（图 S5），IC50 为 3.88μg /mL。 因此，选择 1μg /mL 的 Atezo 处理的共培养细胞组作为 Atezo 组进行后续实验。此外，给予 Atezo 后，干性相关基因的 mRNA 表达水平降低（图 4I）。在球体形成测定中，PD-L1 抑制剂组在第 3 天仍由分散的单细胞组成，而到第 7 天，肿瘤球体的数量和大小明显减少（图 4J）。根据作者的研究结果，作者得出结论，T24 细胞在与 ADSC 共培养后通过增加 PD-L1 表达来增强其干性和 EMT 特性。
ADSCs 通过表达 PD-L1 来促进 T24 细胞的干性。A-C 分析 T24、CM 和 COC 组细胞中 NANOG、OCT4 和 CD44 mRNA 的相对表达;D-E 是 T24、CM 和 COC 组细胞中 NANOG、OCT4 和 CD44 蛋白的相对表达分析;F-H 分析了 P24 和 10：1-COC 组中 PD-L1 的 mRNA 和蛋白的相对表达。S1 和 S2 分别是共培养后 T24 的传代第 1 代和传代第 2 代。I 为 10：1-COC 组 Atezo 在 1 μg/mL 条件下干性因子 Nanog、OCT4 和 CD44 的 mRNA 和蛋白的相对表达;N 是 10：1-COC 组在 1μg/mL Atezo 下进行 3 天和 7 天细胞形成实验的结果;对照是未寻址组的 3 天和 7 天细胞形成实验的结果。N 是 10：1-COC 组在第 3 天和第 7 天以 1μg/ mL 的 Atezo 浓度进行细胞形成测定的结果。对照是 10：1-COC 组中未给药的细胞，*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n = 3。
ADSCs 通过调节 p53 促进 T24 细胞的耐药性
p53 作为一种抑癌基因，在调节细胞周期和凋亡以消除异常细胞，从而防止癌变方面发挥着至关重要的作用。值得注意的是，超过 50% 的恶性肿瘤携带 p53 基因突变，并且源自 BLCA 的 T24 细胞中的所有 p53 基因均属于突变型 （mt-p53）。野生型 p53 通过细胞周期停滞、促进细胞死亡、维持基因组稳定性和抑制肿瘤血管生成等机制，有助于减速或调节细胞分裂。然而，突变后，p53 基因的空间构象发生改变，导致其与细胞生长、细胞凋亡和 DNA 修复相关的调节功能丧失。因此，p53 基因从抗癌基因转变为癌基因27。突变体 p53 不仅失去了原有的功能能力，而且对野生型 p53 的活性具有显性负面影响。此外，它还获得了新的致癌功能，称为“功能获得（GOF）功能”，这与肿瘤的恶性和耐药性特征密切相关 28。
为了研究 ADSCs 对微环境中 T24 细胞耐药性的影响，作者选择了两种常用的临床药物：THP 和厄达替尼。在药物治疗 24 小时后，作者评估了不同组间 T24 细胞的生长情况，并计算了最大半最大抑制浓度 （IC50）。研究结果表明，THP 和厄达替尼均以剂量依赖性方式抑制 BLCA 细胞的增殖;然而，COC 和 CM 降低了 T24 细胞的药物敏感性。T24、CM、10：1-COC、5：1-COC 和 1：1-COC 组 THP 的 IC50 值分别为 149.2 ng/ml、198.2 ng/ml、220.8 ng/ml、202 ng/ml 和 129.6 ng/ml。厄达替尼的 IC50 值分别为 5.138 nM/ml、16.46 nM/ml、22.94 nM/ml、16.68 nM/ml 和 4.078 nM/ml。值得注意的是，在 1：1-COC 组中，药物敏感性没有观察到显着变化（图。5、A-B）。
ADSCs 通过调节 mt-p53 促进 T24 细胞的耐药性。A-B 为两种药物在 T24、CM、10：1-COC、5：1-COC 和 1：1-COC 组的 IC50 结果：THP 的 IC50 分别为 149.2 ng/ml、198.2 ng/ml、220.8 ng/ml、202 ng/ml 和 129.6 ng/ml;厄达替尼为 5.138nM/ml、16.46nM/ml、22.94nM/ml、16.68nM/ml、4.078nM/ml;C-E 是 mt-p53 在 T24、CM、10：1-COC、5：1-COC 和 1：1-COC 组细胞中的 mRNA 和蛋白表达分析;F-G 是添加活化分子 CP-31,398 后 P21、Bax 和 mt-p53 在 T24、CM 和 10：1-COC 组中的表达分析。H-I 是添加 CP-31,398 后两种药物在 T24、CM 和 10：1-COC 组的 IC50 结果：THP 的 IC50 分别为 103.5ng/ml、138.9ng/ml、141.4 ng/ml。厄达替尼的 IC50 分别为 3.37nM/ml、5.944nM/ml、6.5nM/ml。*p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001， n = 3.
作者随后分析了不同组间 mt-p53 的表达，发现与 T24 组相比，COC 组的 mt-p53 显著上调，其中 10：1-COC 组的增加最为显著（图。5、C-E）。作者用 CP-31,398 处理各种细胞群，CP-31,398 是一种苯乙烯基喹唑啉类似物，是第一个被证明可以重新激活突变体 p53 的小分子。该化合物以其保护野生型 p53 免受热变性和恢复某些 p53 突变体的野生型功能的能力而闻名。在向 10：1-COC 组施用浓度为 15μg /ml 的 CP-31,39822 小时 24 小时后，作者观察到先前下调的 P21 和 Bax 表达水平恢复。此外，mt-p53 表达恢复到与野生型 T24 相当的水平，实验组和 T24 组之间没有统计学上的显着差异（图 5 F-G）。同样，各组的药物敏感性均有所增加，T24、CM 和 10：1-COC 组的 IC50 值如下：THP 的 IC50 值分别为 103.5 ng/ml、138.9 ng/ml 和 141.4 ng/ml，而厄达替尼的 IC50 值分别为 3.37 nM/ml、5.944 nM/ml 和 6.5 nM/ml， 分别（图 5 H-I）。
基于这些发现，作者认为与 ADSCs 共培养可增加 mt-p53 表达水平，诱导细胞周期停滞，减少细胞凋亡，并影响 T24 细胞的药物敏感性。而 mt-p53 激活剂（CP-31398）则抵消了这些作用。
CAF 越来越被认为是 TME 中异质和普遍存在的基质细胞29。CAF 的主要来源包括成纤维细胞，脂肪细胞，周细胞，内皮细胞，间充质细胞和上皮细胞 30。然而，ADSC 在 BLCA 中的作用仍不清楚。在这项研究中，作者在使用 T24 细胞的混合培养研究中通过不同比例的 ADSC 证明了 MSC 和肿瘤细胞之间强大的细胞间相互作用。共培养的 T24 细胞表现出功能获得现象，其特征是增殖增强、侵袭和迁移能力增加、EMT、细胞凋亡减少和癌基因显着上调。潜在机制可能涉及诱导肿瘤细胞的干性、增强 EMT 和通过升高 PD-L1 表达进行免疫逃避。此外，这些相互作用可能通过 MDM2 调节细胞侵袭和转移潜力，从而通过 mt-p53 的功能获得促进耐药性（图 6）。因此，ADSC 可能代表 BLCA 微环境中的促癌风险。
ADSC 在微环境中促进 T24 细胞恶性肿瘤的机制示意图。
总结
总体而言，作者的研究表明，BLCA 细胞在与 ADSCs 长期共培养后具有更大的干性、耐药性和免疫逃逸性，表明膀胱癌肿瘤微环境中的长期驻留 ADSC 可能起到促癌作用，尤其在肥胖患者中应受到高度重视。虽然作者在本研究中没有对多个膀胱癌细胞进行验证，但这些结果可以为 ADSCs 在 BLCA 微环境中的促癌作用提供更好的参考价值，参与这一过程的信号通路应该是治疗转移和耐药的潜在靶点 。
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