|
环 RNA ZFR 表达在 HCC 血浆、组织和细胞系中被上调
通过 qRT-PCR 评估了 158 名 HCC 患者、146 名肝硬化患者、140 名乙型肝炎患者及 161 名健康对照组血浆中的 circRNA ZFR 表达水平。此外，通过 qRT-PCR 分析了环 RNA ZFR 在 HCC 及邻近非肿瘤组织中的差异表达，以及 HCC 细胞系和正常肝细胞系。结果显示，HCC 患者血浆中 circRNA ZFR 水平显著升高于健康对照组（P < 0.001;图 1A）。同样，环 RNA ZFR 在肝细胞癌组织中表达较高（见图 1B），其表达在肝细胞系中上调，相较于正常肝细胞系（见图 1C）。通过荧光原位杂交（FISH）进一步验证了 HCC 细胞系中的表达。结果证实，circRNA ZFR 在 HCC 细胞系中表达显著，较正常肝细胞系为 p < 0.01（图 1D）。
HCC 中 CircRNA ZFR 的表达水平。（A）HCC 患者的环 RNA ZFR 表达水平上调优于肝硬化和乙型肝炎患者及健康对照组;（b）与非肿瘤邻近对照组相比，circRNA ZFR 在 HCC 组织中的表达显著更高;（C）HCC 细胞系中 circRNA ZFR 的表达显著高于正常肝细胞系。表达在 BEL7402 细胞系中最高;（D）利用鱼类测定表达 circRNA ZFR。circRNA ZFR 在 HCC 细胞中的表达方式不同。根据表达式，不同的荧光亮度是强 26 还是弱。QSG7701 细胞中 circRNA ZFR 的荧光亮度较弱，意味着表达被下调。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001。
研究参与者的主要人口学和临床特征，包括性别、年龄、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、葡萄糖（GLU）、α-胎儿蛋白（AFP）、乙型肝炎病毒（HBV）、总胆红素（TBIL）和癌胚抗原（CEA），均进行了跨组比较（见表1）).此外，组织样本中，纳入的 HCC 患者根据 circRNA ZFR 阈值分为两组。对其临床数据的分析显示，环 RNA ZFR 水平与肿瘤分期呈正相关，而在 HCC 患者中，未观察到与年龄、性别或远处及淋巴转移率的显著相关性。
circZFR 的过度表达促进了 HCC 的增殖、迁移和体外侵入
为进一步阐明环 RNA ZFR 的生物学功能，分别利用 Hep3B 和 Bel-7402 细胞建立了高表达和低表达的细胞模型。转染效率通过 qRT-PCR 确认（见图）。 阿拉伯数字 C）。CCK-8 检测显示，circRNA ZFR 过表达促进了 Hep3B 细胞的增殖，而 Bel-7402 细胞的敲低则产生相反效果（图 2 B）。此外，circRNA ZFR 过表达增强了 Hep3B 细胞的细胞存活率和菌落形成，而 Bel-7402 细胞的敲低则呈现相反趋势（见图 2C）。随后进行了 EdU 染色测定以评估细胞增殖速率，证实 circRNA ZFR 过表达显著刺激了 HCC 细胞增殖，如假设所示（图 2D）。此外，circRNA ZFR 的过度表达显著加速了刮痕检测中的伤口愈合，这一点从刮痕伤口的迅速闭合可见一斑（图 2 E）。Transwell 检测显示，与 NC 组不同，过度表达环 RNA ZFR 的 Hep3B 细胞的迁移和入侵显著增强，而敲低则表现出相反效果（见图 2F）。综合来看，这些发现证实了环 RNA ZFR 在肝细胞癌进展中的致癌作用。
环 RNA ZFR 影响 HCC 细胞的生长。（A）Bel-7402 细胞中 circRNA ZFR shRNA 的转染效果及 HEP3B c 中 circRNA ZFR 过表达;（B–D）通过 CCK-8、集落形成测定和 EdU 染色测定的 circRNA ZFR 过表达和敲低对 HCC 细胞增殖的影响;（E）通过 Scratch 伤口愈合测定的 circRNA ZFR 过表达和敲低对 HCC 细胞迁移的影响;（F）转染后转染的 Hep3B 和 Bel-7402 细胞的 Transwell 迁移检测。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001。
MiR-96a-5p 是 circRNA ZFR 的功能靶点
环状 RNA 通过结合 miRNA 然后蛋白质来影响其基因调控活性。为了确定 circZFR 的 miRNA 靶点，作者利用 Targetscan、Starbase 和 Circinteractome 数据库中的生物信息学分析，搜索 circZFR 的 miRNA 靶点。维恩图分析显示了三种最相关的 miRNA（miR-96a-5p、miR 107 和 miR-27a-3p）。这些方法通过共转染到过度表达的 circZFR 细胞和 qPCR 得到验证。结果显示 miR-96a-5p 与 circZFR 的相关性最高（图。3A，B）。双重荧光素酶报告器测定通过 miR-96a-5p 过表达诱导野生型报告载体的荧光素酶活性显著下降，且突变报告载体无显著变化，证实了这一相互作用。（图 3C，D）
MiR-96a-5p 是 circRNA ZFR 的功能靶点。（A）利用 Targetscan、starBase 3.0 和 Circinteractome 对结合环 RNA ZFR 的潜在 miRNA 进行生物信息分析;（B）三种潜在 miRNA 的表达水平;（C， D）结合位点及 circRNA ZFR（circ-0072088）与 miR-96a-5p （n = 3） *P < 0.05 之间的 Luciferase 测定;**P < 0.01;P < 0.001。
SLC1A1 是 miR-96a-5p 的直接靶基因
确认 miR-96a-5p 为 circZFR 靶点后，作者再次利用生物信息学分析，通过 Targetscan、miDB 和 Diana 工具寻找 miR-96a-5p 的靶 mRNA。维恩图分析显示，有六种潜在 mRNA 结合环 RNA ZFR（见图）。4A，B）。随后进行了相关分析以评估其与 miR-96a-5p 的关系。SLC1A1 mRNA 显示出最高的相关性（见图 4C–H）。在用 miR-96a-5p 抑制剂（anti-miR-96a-5p）转染后，其表达在细胞中被观察到上调，因此与 miR-96a-5p 呈负相关（Fig. 4I，J）。
鉴定 miR-96a-5p 在 HCC 中下游靶蛋白的鉴定。（A，B） 利用 Targetscan、mirDB 和 Diana 对结合 miR-96a-5p 的潜在 mRNA 进行生物信息分析;（C–H）miR-96a-5p 表达与潜在 mRNA 表达之间的相关分析;（ 第一 ，J）通过 western 印迹法，miR-96a-5P 过表达和抑制剂对 HCC 中 SLC1A1 表达的影响;（K，L） miR-96a-5p 与 SLC1A1 之间的结合位点及双荧光素酶报告测定。
为验证该发现，进行了双重荧光素酶报告测验，测试 miR96a-5p 与预测的 SLC1A1 3′-UTR 靶向序列之间的相互作用。SLC1A1 3′-UTR 含有一个疑似 miR-96a-5p 的结合位点。值得注意的是，野生型 SLC1A1 3′-UTR 在 miR-96a-5p 抑制剂存在下表现出更高的荧光素酶活性，而在 miR-96a-5p 模拟体存在下荧光素酶活性较低。相比之下，SLC1A13′-UTR 的结合位点突变体与对照组未表现出任何差异。（图。4K，L）。
此外，为了确认环 RNA ZFR 引导 SLC1A1 调控的精确机制，作者使用生物素标记寡核苷通过 RNA 纯化（ChIP）分离染色质。由于作者之前已证明环 RNA ZFR 调控 SLC1A1 表达，作者选择 SLC1A1 启动子作为检测位点，GAPDH 作为对照。ChIP-PCR 显示，环 RNA ZFR 在 HCC 细胞系的 SLC1A1 启动子区域富集。然而，作者未观察到在抑制环 RNA ZFR 后，SLC1A1 启动子处的环 RNA ZFR 富集（见图。5A，B），表明 circRNA ZFR 可以直接结合 SLC1A1 启动子。将 FC 和结合评分、KEGG 通路分析（见图 5C）及与人类癌症的关联作为筛查标准 ，只有 PPAR 信号通路与 HCC a 相关，因此仅被选中进行进一步验证。此外，还鉴定了 SLC1A1 的肽序列（见图 5D）。
验证 miR-96a-5p 在 HCC 中下游靶点。（A）用于筛选 miR-96a-5p 下游靶蛋白的 ChIRP/MS 工作流图。（b）ChIP-PCR 分析，选定 GAPDH 启动子区域为阴性对照。未处理细胞的值被设定为。ImageJ 用于定量 miR-96a-5p 的结合;（C）对 miR-96a-5p 可能参与的信号通路进行 KEGG 通路分析。Anlyssis 使用 KEGG 数据库进行 25;C，MS 鉴定的 SLC1A1 肽序列。
进行了体内实验以验证细胞培养研究的发现。研究共使用了 11 只 8 周龄的 Balb/c 裸鼠。实验组注射了过度表达环 RNA ZFR 的肝炎 3B 细胞，而对照组则接受生理盐水。经过 21 天观察期，实验组肿瘤显著大于对照组（见图。6A–C），表明 circRNA ZFR 过表达加速体内肝细胞癌肿瘤的进展。免疫组化分析显示，circRNA ZFR 过表达组肝脏中转移细胞的存在增加，表明 circRNA ZFR 具有促进转移的效果。此外，在肿瘤组织中 circRNA ZFR 过表达，SLC1A1 蛋白表达水平显著上调，Ki-67 表达升高（见图 6D，E）。相关分析进一步显示，circRNA ZFR 与 SLC1A1 表达水平呈正相关（见图 6F）。
体内实验阐明了环 RNA ZFR 在 HCC 中过度表达的影响。（A）裸鼠中由环 RNA ZFR 或 NC 形成的异种移植肿瘤;（B）肿瘤体积增长曲线;（C）肿瘤权重，肿瘤的连接点;（D） Ki-67 和 SLC1A1 的 IHC 染色;（E）肿瘤切片增殖指数（Ki-67 比例）及 SLC1A1 水平的定量化：**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。（F）circRNA ZFR 与 SLC1A1 之间的相关分析。
总结
总之，作者对 HCC 中的致癌性环 ZFR 进行了表征和功能分析。作者证明环 ZFR 在 HCC 中表达升高。作者提供了证据，表明环 ZFR 敲低抑制通过海绵化 miR-96a-5p 并调节 SLC1A1 表达，延缓了 HCC 的进展。这些研究表明，circZFR/miR-96a-5p/SLC1A1 轴可能成为 HCC 的潜在治疗靶点。
|
