尽管模型生物已经为心脏和肝脏血管化的最早阶段提供了见解，但由于伦理限制和在早期发育阶段获得胚胎的技术困难，使得人们对这一过程知之甚少。斯坦福大学医学院的Joseph C Wu教授团队证明了微图案化的人多能干细胞衍生的类胃原体能够在体外模拟血管化的最早阶段。并确定了血管诱导因子的组合，这些因子导致心脏血管化类器官具有空间组织和分支血管网络。此外，还使用相同的血管化诱导因子来产生肝血管化类器官，显示了该血管化策略的更广泛的效用。
人多能干细胞（hPSCs）可以分化成各种细胞类型，如心肌细胞（CMs）、肝细胞（HCs）和单独类型的心血管细胞，包括内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs），周细胞（PCs）、成纤维细胞（FBs）、心内膜细胞（ENDOs）和心外膜细胞（EPIs）。经典的组织工程方法已经用于使用分别分化的ECs和基质细胞产生血管化的心脏和肝组织。转录因子ETV2、GATA6和NGN1的强制过表达已用于诱导各种类型的类器官中的ECs形成。此外，立体光刻和三维（3D）生物打印已用于在肝和心脏细胞聚集体内产生血管网络。体内植入也实现了肾和脑类器官的新生血管化。尽管自组织方法已被用于成功地产生血管类器官，但用这些方法产生的心脏类器官和肝脏类器官都具有可变水平的ECs、SMCs和PCs；此外，没有解决这些细胞类型是否形成具有管腔的分支血管系统。因此，在分化类器官的关键细胞类型的同时，重新建立一个包括强健分支、分层组织和管腔形成的脉管系统尚未完全实现，这凸显了类器官研究的一个主要瓶颈。
1. hPSCs的微图案化导致空间组织的类胃细胞、心血管祖细胞和CMs
在多孔板的每个孔中，用一个等离子体处理过的带中心孔的橡胶模板来创建圆形hPSC单层微图案（图1A）。微图案化的hPSC具有多能性，其中2毫米的微图案化能最稳定地形成完全汇合，CM与微图案面积之比最高（图1，B和C）。图1D显示了48孔板的四个孔中心的2 mm hPSC微图案（蓝色）。然后，使用hESC-ERRUES-ERGLR细胞系在不同浓度的GSK3β抑制剂（CHIR）作用下，观察无图案化与微图案化hPSC中的胚层形成（图1，E和F）。在不同浓度CHIR的诱导下，第6天无图案化的RUES-GLR hESC产生了无序的胚层，而微图案化组则始终产生有序的胚层。在4 μM CHIR诱导后，中心BRA+中胚层区域被SOX17+内胚层环包围，而SOX2+外胚层不存在。相比之下，SOX2在所有CHIR浓度下以无序的方式在未图案化组中表达（图1G）。接下来，使用hESC-pNKX2-pN5-pN5-eGFP细胞系来观察微图案化对心血管祖细胞形成的影响（图1H）。结果发现，单个NKX2-NK5-NKeGFP微图案分化10天后，产生了有组织的环形形态的NKX2-NK5-NKeGFP+心血管祖细胞，导致跳动的CM（图1I）。使用hESC-TNNT2-GFP荧光报告细胞系，发现6 μm的微模式可以分化成CM（图1，J和K）。此时，使用三种荧光hPSC报告细胞系（hESC-RUESGLR、hESC-NKX2-5-eGFP和hESC-TNNT2-GFP），证明了微图案化产生了有组织的胚层、心血管祖细胞和CMs，从而为cVO的形成条件提供了基础。为了按比例放大微图案形成，使用具有2mm孔阵列的单个等离子体蚀刻处理的橡胶模板来产生阵列化的hPSC微图案。对于6孔板，每个孔可以产生多达77个微图案，总共462个微图案，产生462个GFP+ CM菌落（图1，L和M）。
图1 hPSC的微图案化导致空间组织化的胃样细胞、心血管祖细胞和心肌细胞。
2. 三重报告细胞系的产生可优化形成cVO的分化条件
为了便于筛选cVO形成的各种分化条件，建立了一个hESCs三重报告细胞系（hESCTNNT2-GFP/CDH5-mOrange/TAGLN-GFP-CFP）（hESC-3R）（图2A）。使用对CMs、ECs和SMCs特异性的分化方案，观察到hESC-3R系中内源性表达的标签和细胞类型特异性标志物的抗体染色之间的荧光信号重叠（图2B）。图2C示意图显示了用于产生CMs、ECs、SMCs和cVOs的时间轴、阶段、细胞类型、几何形状、培养基和生长因子。与对照组相比，条件32下有更多的CM、EC和SMC形成（图2，D和E）。对照和条件32的CM形成的时程显示，CMs在第8天左右出现，并且到第12天，在条件32中存在显著更多的CMs（图3，A-D）。EC在对照组和条件32中均在第3天已经存在，而在条件32中，它们的形成在CM形成前几天在第5天左右开始增加；到第12天，在条件32中存在显著更多的EC（图3，E-H）。在条件32中，SMC在第8天左右开始增加，并且到第12天，存在显著更多的SMC（图3，I-L）。总之，条件32，产生具有最多CMs、ECs和SMCs的cVOs。
图2 三重报告基因系的产生使得能够筛选导致cVO形成的分化条件。
图3 筛选鉴定同时产生心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞以形成cVO的分化条件。
3. cVOs包括心肌、血管、内皮、心外膜和神经元细胞类型
在将cVO的分化从12天延长至16天后，CMs、SMCs和分支ECs以同心方式排列（图4，A和B）。hESC-3R微图案和cVOs的3D表面渲染显示，cVOs在z轴和体积上显著发展（图4C）。此外，还证实了CMs共表达肌钙蛋白-cTnT（TnT）和TNNT2-GFP，ECs共表达CD31和CDH5-mOrange，SMCs共表达钙蛋白和TAGLN-GFP（图4，D-F）。hESC-ESC 3R微图案的阵列也分化成cVO，并且含有以同心方式排列的CM、SMC和分支EC（图4，G和H）。接下来对单个未分化的微图案化hESC-ESC 3R集落，对照和cVOs进行时间批量RNA-Seq测序（bRNA-Seq）。加权基因共表达网络分析显示，在16天内，多能性、中胚层、CV祖细胞、CM、EC、SMC、FB和血管化基因聚集。血管形成基因在cVOs中最高，并在第16天达到峰值（图4 I）。与cVO相比，对照组的CM基因更高；对于EC和NOTCH-DELTA-JAG基因，在第5天开始，对照和cVOs之间存在差异；并且两组的SMC/ PC基因通常都增加（图4J）。用Azimuth人成人心脏scRNA-测序参考集进行聚类注释，揭示了cVOs和6.5-PCW心脏中的多种心肌、血管、内膜、心外膜和神经元细胞类型（图4K）。cVO和6.5-cVPCW心脏分别包含15至17和16种心脏细胞类型。成纤维细胞和间皮瘤/心外膜类型占大多数cVO细胞类型，而与其他两组相比，造血细胞类型在cVOs中最少（图4L）。6.5-PCW心脏是迄今为止最早的体内scRNA-PCR测序数据集，但仍然比该研究的cVOs大约3.5周；因此，预期该研究的cVOs不会具有在6.5-PCW心脏或Azimuth成人心脏参考中发现的所有细胞类型。
图4 cVOs包括多种心肌、血管、心内膜、心外膜和神经元细胞类型。
4. cVOs包括在空间上与心房、心室、内膜、心外膜和神经元细胞类型整合的分支和管腔化脉管系统
为了进一步表征cVO内的心肌、血管、内膜、心外膜和神经元细胞类型，使用最大强度投影（MIP）共聚焦成像和Imaris软件支持的各种细胞类型特异性标记物的3D表面渲染。cVOs包含CD31+ EC分支，周围有PDGFR-β+ PC，它们与与TNNT2-GFP+ CMs相互融合并穿透TNNT2-GFP+ CMs，SM22α+ SMCs则围绕分支ECs（图5， A和B）。图5A所示cVO的Imaris 3D表面渲染显示了与CM环整合的ECs网络，其中ECs形成直径为4至40 μm的血管分支（图5，C和D）。血管分支长度、直径、总长度和总体积与微血管表型一致（图5E）。Imaris 3D表面渲染显示cVO内的EC形成具有直径约20 μm的三个管腔的分支（图5F）。进行了共聚焦成像显示了CMs、分支ECs和ECs分支内包含的直径1- 10 μm的深红色微球，确认了管腔形成（图5G）。Imaris 3D表面渲染显示，在TNNT 2-GFP+ CMs内，PDGFR-β+ PCs围绕着分枝的CD31+ ECs（图5H）。高倍放大和高分辨率3D共聚焦成像显示ECs在CM区域内外形成直径约为10 μm的管腔；细胞质膜的麦胚凝集素（WGA）染色也证实了管腔形成（图5，I-K）。
MIP共聚焦图像显示NFATC1+ ENDOs的内环被CMs的外环包围并与ECs整合（图6A）。WT1+/TBX18+ EPIs在cVO中心内以及靠近CMs和ECs处被识别（图6 B）。DDR2+、DCN+和LUM+成纤维细胞还散布有MYH6+/TNNT2-GFP+ CMs和CD31+ ECs（图6C）。最后，鉴定了散布有CMs和ECs的β-微管蛋白Ⅲ+神经元细胞（图6D）。
图5 cVOs包括与心肌细胞空间整合的分支和管腔化脉管系统
5. 如多项功能评估所示，与对照组相比，cVO搏动较慢，电、钙和收缩持续时间较长
使用了多电极阵列（MEA）电生理学（EP）、尖电极EP、钙瞬变分析、收缩分析和一氧化氮（NO）测试，以表征cVOs的功能。MEA EP显示，cVOs搏动显著慢于对照组，而尖峰振幅无显著差异（图6，E和F）。尖电极EP显示，与对照组相比，cVO心室肌样CMs中90%复极化时的校正动作电位时程显著更高，但心房肌样CMs无显著差异（图6，G和H）。尖电极EP数据显示，与对照相比，分析的cVO包括更多的心房-心室样CMs和更少的心室-心室样CMs（图6 I）。此外，对照组和cVO的搏动率均随着异丙肾上腺素的添加而增加，在每个浓度下，cVO率始终低于对照组率（图6 J）。最后，还观察到与对照相比，cVO ECs中的NO分泌显著更高（图6 K）。
图6 cVOs包括空间整合的心房、心室、心内膜、心外膜和神经元细胞类型。
6. cVO血管化因子也能产生hVOs
接下来探究该cVO血管化类策略是否可以用于肝脏。通过诱导中胚层，然后对EC、SMC和HC进行共分化，以产生所有三种细胞类型（图7A）。测试了以下三种分化条件：hVO-对照，hVO-D3，和hVO-D6。血管形成基因在hVO-D3组中上调最多（图7B）。bRNA-测序结果显示，hVO-D3组的肝、胆管细胞、ECs和SMCs基因的表达上调最多，其中CDH5和TAGLN高于其他组（图7C）。在第3天（hVO-PD3组）将血管因子添加到基线肝分化方案中在第19天生成最高的EC（图7，D-F）。共聚焦荧光成像证实了在分化的第19天未成熟HC和EC的共分化（图7G）。hVOs包括血管，其中ECs与位于中心的SMCs整合，并且THBD和LYVE标志物与CD 31 +/CDH 5-α CFP+和SMA + EC共定位（图7，H和I）。与未成熟的AFP+ HCs一起分散的是围绕位于中心的TAGLN-10 CFP+ SMC的CK19+胆管细胞（图7J）。hVOs由CD31+ EC/LSEC分支与AFP+未成熟HC整合而成（图7，K和L）。同一hVO的Imaris 3D表面渲染图显示，与AFP+未成熟HC整合的EC网络，其中EC形成直径范围为4至70 μm的血管分支，平均大于cVO的血管分支（图7，M和N）。且hVO血管具有比cVO血管显著更大的平均分支长度、直径和体积（图7O）。
图7 用于产生cVOs的血管化因子可用于产生hVOs。
该研究的体外模型代表了一种技术进步，解决了有关从头器官血管化的问题。此外，该研究结果表明，在不同的器官系统内，血管系统的形成涉及一个保守的发育程序。
参考文献
Abilez OJ, Yang H, Guan Y, Shen M, Yildirim Z, Zhuge Y, Venkateshappa R, Zhao SR, Gomez AH, El-Mokahal M, Dunkenberger L, Ono Y, Shibata M, Nwokoye PN, Tian L, Wilson KD, Lyall EH, Jia F, Wo HT, Zhou G, Aldana B, Karakikes I, Obal D, Peltz G, Zarins CK, Wu JC. Gastruloids enable modeling of the earliest stages of human cardiac and hepatic vascularization. Science. 2025 Jun 5;388(6751):eadu9375. doi: 10.1126/science.adu9375IF: 45.8 Q1 IF: 45.8 Q1 B1. Epub 2025 Jun 5. PMID: 40472086 IF: 45.8 Q1 B1.